人关节韧带成纤维细胞的培养方法及核心操作流程！

 

人关节韧带成纤维细胞是一种存在于关节韧带组织中的细胞类型，对维持关节韧带的结构和功能具有重要作用。

 

人关节韧带成纤维细胞的培养需遵循“组织获取 - 细胞分离 - 原代培养 - 传代培养”的核心流程，关键在于保证细胞活性和纯度，以下是详细方法介绍：

 

一、前期准备：材料与试剂

 

培养前需提前备好专用耗材和试剂，避免操作中污染或影响细胞活性。

 

1、基础试剂：

 

培养基：常用 DMEM/F12（1:1）基础培养基，需添加 10%-15% 胎牛血清（FBS，灭活处理）、1% 青霉素 - 链霉素（双抗，防止细菌污染）、5ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、1μg/mL 胰岛素。

 

消化液：0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 混合液（用于解离组织和细胞）、0.1% 胶原酶 I（辅助分解韧带组织中的胶原纤维，提高细胞分离效率）。

 

其他：磷酸盐缓冲液（PBS，无钙镁离子型，用于清洗组织和细胞）、75% 乙醇（消毒用）、无菌 Hank's 液（暂存组织）。

 

2、耗材与设备：

 

耗材：无菌培养皿（60mm/100mm）、离心管（15mL/50mL）、移液管（1mL/5mL/10mL）、细胞筛（70μm，过滤组织残渣）、无菌手术剪刀、镊子、刮勺。

 

设备：CO培养箱（设定 37、5% CO、95% 湿度）、超净工作台（无菌操作环境）、离心机（室温，1000-1500rpm）、倒置显微镜（观察细胞形态）。

 

二、核心培养流程：从组织到细胞

 

1、组织获取与预处理（关键：无菌 + 去杂质）

 

来源：通常取自新鲜的人关节韧带组织（如手术切除的髌韧带、交叉韧带，需符合伦理规范）。

 

预处理步骤：

 

将获取的韧带组织放入含双抗的无菌 Hank's 液中，快速转移至超净台，用 75% 乙醇浸泡 10-15 秒消毒表面，再用无菌 PBS 反复冲洗 3-5 次，去除血迹和表面杂质。

 

用无菌剪刀将组织剪成 1-2mm³ 的细小碎块（越小越易消化），弃去可见的脂肪、血管等非韧带组织（避免杂细胞污染）。

 

2、细胞分离：消化法解离组织

 

采用“胶原酶 + 胰蛋白酶”两步消化法，温和解离韧带组织中的成纤维细胞，避免过度消化损伤细胞。

 

第一步（胶原酶消化）：将组织碎块转移至 15mL 离心管，加入 3-5mL 0.1% 胶原酶 I，37水浴振荡消化 2-4 小时（每隔 30 分钟轻轻颠倒离心管 1 次，观察组织是否松散）。

 

第二步（胰酶消化）：消化后加入等体积含 FBS 的培养基终止胶原酶作用，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清；向沉淀中加入 2-3mL 胰蛋白酶 - EDTA 混合液，37孵育 10-15 分钟，期间在倒置显微镜下观察，当细胞开始变圆、脱离组织块时，立即加入含 FBS 的培养基终止消化。

 

过滤与清洗：将消化液通过 70μm 细胞筛过滤，去除未消化的组织残渣，收集滤液至离心管，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清；用无菌 PBS 重悬细胞沉淀，重复离心 1 次，彻底去除残留消化液。

 

3、原代培养：细胞贴壁与增殖

 

原代培养是细胞适应体外环境的关键阶段，需严格控制培养条件。

 

细胞接种：将清洗后的细胞沉淀用配置好的完全培养基重悬，轻轻吹打制成单细胞悬液，滴加至 60mm 培养皿中（细胞密度控制在 5×10-1×10个 /cm²），轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。

 

培养环境：将培养皿放入 CO培养箱，设定 37、5% CO、95% 湿度，静置培养 24-48 小时（前 24 小时尽量不移动培养皿，避免影响细胞贴壁）。

 

换液与观察：培养 24 小时后，在倒置显微镜下观察，可见部分纺锤形细胞开始贴壁；此时更换新鲜完全培养基，去除未贴壁的死细胞和杂质；之后每 2-3 天换液 1 次，观察细胞生长状态（正常成纤维细胞呈梭形，排列有序，增殖至 70%-80% 汇合时可进行传代）。

 

4、传代培养：维持细胞活性与纯度

 

当原代细胞生长至培养皿表面积的 70%-80%（细胞间无明显空隙）时，需及时传代，避免细胞过度密集导致衰老。

 

消化解离：弃去培养皿中的旧培养基，用无菌 PBS 冲洗细胞表面 2 次，去除残留血清；加入 2-3mL 胰蛋白酶 - EDTA 混合液，覆盖细胞层，37孵育 3-5 分钟，倒置显微镜下观察到细胞变圆、间隙增大时，立即加入含 FBS 的培养基终止消化。

 

细胞收集：用无菌刮勺轻轻刮擦培养皿底部，使贴壁细胞完全脱落，加入适量完全培养基，轻轻吹打制成单细胞悬液；将悬液转移至离心管，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清。

 

接种传代：用完全培养基重悬细胞沉淀，按 1:2 的比例接种至新的培养皿（传代比例不宜过高，1:2-1:3 最佳，保证细胞增殖空间）；放入 CO培养箱继续培养，后续每 2-3 天换液 1 次，通常可稳定传 3-5 代（超过 5 代后细胞可能出现增殖缓慢、形态改变，建议用于实验的细胞不超过 3 代）。

 

三、关键注意事项：避免污染与细胞损伤

 

无菌操作：全程在超净工作台内进行，操作前用 75% 乙醇消毒双手和台面，耗材和试剂需提前灭菌（或使用无菌商品化产品），避免细菌、真菌或支原体污染（若发现培养基浑浊、出现絮状物，需立即丢弃污染细胞）。

 

消化控制：胰蛋白酶和胶原酶的消化时间需严格把控，过度消化会破坏细胞表面结构，导致细胞死亡；消化不足则细胞难以脱落，影响传代效率，建议根据细胞状态灵活调整（如原代细胞消化时间可稍长，传代细胞消化时间缩短）。

 

细胞纯度验证：培养过程中可通过免疫荧光染色验证纯度，常用波形蛋白染色，阳性率需达到 90% 以上，若杂细胞较多（如内皮细胞、平滑肌细胞），可采用差速贴壁法（成纤维细胞贴壁速度快于杂细胞，2 小时内贴壁的细胞纯度更高）进一步纯化。

 

四、常见问题与解决方案

 

问题现象       可能原因       解决方案

 

细胞贴壁率低 消化过度/培养基成分不足/细胞活性差 缩短消化时间，补充 bFGF 和胰岛素，选用新鲜组织

 

培养基浑浊、有异味 细菌或真菌污染 立即丢弃污染细胞，彻底消毒培养箱，更换新试剂

 

细胞增殖缓慢、形态变圆 细胞过度密集/传代次数过多 及时传代（不超过 80% 汇合），使用 3 代内的细胞

 

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