微生物分离之双层平板法操作技巧与步骤及注意事项！

 

一、定义

 

双层平板法，又叫双层琼脂平板法，顾名思义，两层固体培养基的平板，具体是指由一个培养皿内倒入底层固体培养基和上层固体培养基形成的双层平板，进行检测噬菌体或其他抗性的过程就叫双层平板法。

 

二、原理

 

先在培养皿中倒入底层固体培养基，待其凝固后倒入含有检测菌的上层培养基，经培养后，上层培养基会发生变化，比如说出现噬菌斑或抑菌圈或其他，以此来计算噬菌斑的数量，测定抗生素效价等。

 

三、双层平板法的应用1-噬菌体的分离培养

 

1、试验详细操作步骤

 

(1)配制底层培养基和上层培养基

 

底层培养基琼脂粉含量：1.5%-2%。

 

底层培养基培养基：无菌水加1.5%-2%琼脂粉，灭菌，待冷却至50倒平板，凝固后备用。

 

上层培养基琼脂粉含量：1%。

 

上层培养基培养基：根据检测菌种进行确定，灭菌后放入水浴锅中，备用。比如说，检测噬菌体，可以选用LB固体培养基。

 

(2)倾倒上层培养基

 

一般情况，待测样品为噬菌体污染的样品。

 

取培养基：取出上层培养基，冷却至45左右。

 

取样品：用移液器取样品0.5mL放入上层培养基中。

 

取试验菌：接着用移液器吸取大肠杆菌菌液0.2mL，也放入上层培养基中，沿壁摇匀。

 

倾倒平板：将上述混合液快速倒入底层培养基上面，凝固。

 

(3)培养

 

上层培养基凝固后，放置于恒温培养箱中倒置培养。

 

(4)观察，计算。

 

2、操作技巧：

 

(1)底层培养基不宜太厚，覆盖培养皿底部即可。

 

太厚上层培养基无法倒入，太薄不能覆盖培养皿底部，起不到应有的作用。

 

(2)上层培养基灭菌完成后，要摇匀放入水浴锅中，间隔沿壁摇动。

 

经常摇动，培养基不容易出现结块。

 

(3)水浴锅温度调至60，温度不宜太高或太低。

 

温度太高，想用的时候冷却较慢；温度太低，凝固的又太快。

 

(4)上层培养基温度降至45左右，再加入污染菌液和试验菌。

 

这个温度既能保证培养基和菌液混匀，又能保证不凝固不结块。

 

(5)上层培养基要沿壁摇匀，尽量避免产生气泡。

 

气泡太多，噬菌斑锯齿状，很难看。

 

(6)控制好试验菌浓度。一般正好覆盖一层菌液为好。

 

3、注意事项：

 

(1)酒精灯旁边操作，时刻保持无菌意识。

 

(2)双层平板法相对厚度不易把握，一定要看准，不能溢出或太厚。

 

(3)试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出，该灭菌的物品一定要灭菌后再处理，避免交叉污染。

 

(4)试验过程中，尽量减少人员流动。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！