兔子宫内膜上皮细胞永生化的实验过程与操作步骤！

 

兔子宫内膜上皮细胞（REECs）的永生化是一个系统性实验过程，需经过原代细胞分离纯化、永生化基因导入、阳性细胞筛选及功能鉴定等关键步骤，每个环节都需严格控制操作以确保细胞活性和特性。以下是具体步骤的详细说明：

 

一、实验准备与材料预处理

 

1、实验动物选择与取材

 

选用健康雌性成年兔，处死后 30 分钟内无菌操作取子宫组织（避开月经期，可提高上皮细胞活性）。

 

用预冷的 PBS（含双抗：100U/mL 青霉素 + 100μg/mL 链霉素）冲洗子宫腔，去除血液和分泌物，剥离子宫内膜层（用眼科剪小心分离内膜与肌层，避免肌层污染）。

 

2、试剂与耗材准备

 

消化液：0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA（过滤除菌，4保存）；

 

培养基：DMEM/F12（含 10% 胎牛血清、1% 双抗），37预热；

 

其他：无菌培养皿、200 目筛网、离心管、手术器械等，均经高压灭菌处理。

 

二、原代兔子宫内膜上皮细胞的分离与纯化

 

1、组织消化

 

将剥离的子宫内膜剪成 1-2mm³ 的小块，加入 5-10 倍体积的胰蛋白酶 - EDTA 消化液，37水浴震荡消化 15-20 分钟（每隔 5 分钟轻轻吹打一次，避免过度消化损伤细胞）。

 

加入等量含血清的培养基终止消化，用吸管反复吹打组织块至细胞分散，过 200 目筛网去除未消化的组织碎片，收集细胞悬液。

 

2、离心与接种

 

细胞悬液 1000rpm 离心 5 分钟，弃上清，用培养基重悬细胞，计数后按 1×10个 /mL 密度接种于培养瓶中。

 

3、差速贴壁纯化

 

接种后 1-2 小时，间质细胞会优先贴壁，而上皮细胞贴壁较慢。此时轻轻吸出未贴壁的细胞悬液，转移至新培养瓶中，可去除大部分间质细胞（重复 1-2 次可提高纯度）。

 

纯化后的细胞在 37、5% CO培养箱中培养，24 小时后更换培养基，去除死细胞，后续每 2-3 天换液一次。

 

4、原代细胞传代

 

当细胞融合至 80%-90% 时，用胰蛋白酶消化传代（原代细胞通常传至 5-8 代后出现衰老，表现为细胞扁平、增殖减慢，此时需进行永生化处理）。

 

三、永生化基因导入（以 TERT 转染为例，最常用且表型保真度高）

 

1、重组载体构建

 

克隆兔 TERT 基因（或使用人 TERT 基因，序列已明确），插入慢病毒载体，构建重组表达载体（需测序验证基因序列正确性）。

 

包装慢病毒：将重组载体与包装质粒共转染 293T 细胞，48-72 小时后收集病毒上清，过滤浓缩（病毒滴度需≥1×10 TU/mL）。

 

2、细胞转染

 

取第 3-5 代对数生长期的原代 REECs，接种于 6 孔板（细胞密度约 50% 融合），培养 24 小时。

 

加入慢病毒液，同时加入 5μg/mL 聚凝胺促进病毒感染，37培养 24 小时后更换新鲜培养基。

 

3、阳性细胞筛选

 

转染 48 小时后，加入含 2μg/mL 嘌呤霉素的培养基筛选（根据预实验确定最佳筛选浓度），每 2-3 天换液一次，持续 7-10 天，直至未转染的对照组细胞全部死亡，存活细胞即为稳定表达 TERT 的阳性克隆。

 

挑取单克隆细胞（用克隆环或有限稀释法），扩大培养获得单克隆细胞株。

 

四、永生化细胞的鉴定（核心步骤，确保细胞功能与安全性）

 

1、增殖能力鉴定

 

连续传代观察：将细胞连续传代至 30 代以上，记录每代倍增时间（永生化细胞倍增时间应稳定，无明显延长）。

 

CCK-8 法检测活性：对比永生化细胞与原代细胞（第 5 代）的增殖曲线，永生化细胞应保持较高增殖活性。

 

端粒酶活性检测：用 TRAP 法（端粒重复扩增法）检测端粒酶活性，永生化细胞应呈阳性（原代衰老细胞为阴性）。

 

2、上皮细胞表型验证

 

形态学观察：镜下应为典型上皮细胞形态（多边形、紧密排列呈铺路石样），无成纤维细胞样形态（长梭形）。

 

标志物检测：

 

免疫荧光：检测细胞角蛋白 18（CK18）、E - 钙粘蛋白的表达（上皮细胞特异性），应为阳性；

 

Western blot：验证 CK18 表达，同时检测波形蛋白应为阴性，排除污染。

 

3、生物学功能验证

 

激素响应性：用 10mol/L 雌激素（E2）处理细胞 48 小时，通过 RT-PCR 检测雌激素受体（ERα）及下游基因的表达上调，证明其保留子宫内膜上皮的激素应答功能。

 

分泌功能：检测细胞培养液中子宫内膜特异性因子的含量（ELISA 法），与原代细胞无显著差异。

 

4、安全性鉴定

 

核型分析：通过染色体显带技术检测细胞染色体数目和结构，应与原代兔细胞一致（兔正常染色体数 2n=44），无明显异常。

 

致瘤性检测：软琼脂克隆形成实验（永生化细胞应无法形成克隆，恶性细胞为阳性）；裸鼠皮下接种实验（观察 8 周，无肿瘤形成）。

 

五、细胞冻存与保种

 

对鉴定合格的永生化细胞，用含 10% DMSO+90% 胎牛血清的冻存液重悬，分装至冻存管，梯度降温（4 30 分钟→-20 1 小时→-80过夜→液氮长期保存），便于后续实验使用。

 

以上步骤需严格无菌操作，且永生化方法可根据实验需求选择。核心目标是获得 “增殖无限、表型稳定、功能正常、安全无瘤” 的永生化兔子宫内膜上皮细胞模型。

 

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