分子生物学实验中细胞裂解与DNA提取操作流程！

 

百欧博伟生物：细胞裂解和DNA提取是分子生物学实验中的基础步骤，广泛应用于基因克隆、PCR、测序等领域。以下是详细流程和关键点：

 

一、细胞裂解（Cell Lysis）

 

目的：破坏细胞膜/壁，释放细胞内成分（包括DNA、RNA、蛋白质等）。

 

1、裂解方法

 

物理法：

 

研磨/匀浆：适用于植物、动物组织（液氮冷冻后研磨更高效）。

 

超声破碎：常用于细菌或培养细胞（需控制功率和时间，避免DNA断裂）。

 

冻融循环：反复冷冻（液氮）与解冻，破坏细胞膜。

 

化学法：

 

去垢剂：SDS（十二烷基硫酸钠）等溶解膜脂质。

 

酶解法：

 

溶菌酶：裂解细菌细胞壁（如革兰氏阳性菌）。

 

蛋白酶K：消化蛋白质（尤其是组蛋白结合DNA）。

 

高盐缓冲液：破坏细胞膜并抑制DNase活性。

 

2、关键步骤

 

样本预处理：

 

动物组织：需去除结缔组织和脂肪。

 

植物样本：需去除多糖和多酚。

 

细菌/真菌：需预处理细胞壁。

 

缓冲液选择：

 

裂解缓冲液：含SDS、Tris-HCl（pH 8.0）、EDTA（螯合Mg²抑制DNase）。

 

植物样本：常用CTAB缓冲液（十六烷基三甲基溴化铵）去除多糖。

 

二、DNA提取（DNA Purification）

 

目的：纯化DNA，去除蛋白质、RNA、脂类等杂质。

 

1、基本流程

 

去除蛋白质：

 

蛋白酶K消化：37°C孵育1小时（降解蛋白质）。

 

盐析法：高浓度NaCl或KAc沉淀蛋白质。

 

苯酚-氯仿抽提：变性蛋白质并离心分离（上层水相含DNA）。

 

去除RNA：

 

加入RNase A（需后续纯化去除酶）。

 

DNA沉淀：

 

乙醇/异丙醇沉淀：加入2倍体积冷乙醇（-20°C）沉淀DNA。

 

离心收集：12,000 rpm离心10分钟，弃上清。

 

洗涤与溶解：

 

70%乙醇洗涤：去除盐离子。

 

溶解DNA：TE缓冲液（pH 8.0）或无菌水。

 

2、替代方法

 

硅胶膜柱法（试剂盒）：

 

DNA结合硅胶膜→洗涤→洗脱（快速、高纯度，适用于微量样本）。

 

磁珠法：

 

磁珠吸附DNA→磁场分离（适合高通量自动化）。

 

三、关键注意事项

 

1、防止DNA降解：

 

全程在冰上操作（抑制DNase活性）。

 

使用EDTA缓冲液螯合金属离子。

 

2、提高产量：

 

裂解彻底（延长蛋白酶K消化时间）。

 

避免过度超声或剧烈振荡（防止DNA断裂）。

 

3、提高纯度：

 

充分去除蛋白质。

 

洗涤时彻底去除乙醇（残留影响下游实验）。

 

4、特殊样本处理：

 

血液：红细胞裂解液预处理。

 

植物：CTAB法+β-巯基乙醇（抑制氧化）。

 

四、常见问题与解决

 

 

 

五、应用场景

 

临床诊断：从血液或组织中提取DNA用于遗传病检测。

 

农业育种：植物DNA提取用于分子标记辅助选择。

 

法医学：微量DNA提取用于STR分析。

 

微生物学：细菌基因组提取用于耐药基因研究。

 

通过优化裂解条件和纯化步骤，可获得高质量DNA（A260/A280≈1.8，片段完整）。对于初学者，推荐使用商业试剂盒，操作简便且稳定性高。

 

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