原代呼吸道上皮细胞的培养与操作步骤及注意事项！

百欧博伟生物：原代呼吸道上皮细胞培养的核心是取材新鲜、无菌操作、模拟体内微环境，常用方法为组织块法或酶消化法，以下是详细步骤：

一、实验准备

材料准备：新鲜呼吸道组织（人/大鼠/小鼠等）、专用培养基、消化酶（胰蛋白酶、胶原酶 ）、PBS 缓冲液、双抗（青霉素/链霉素）、培养皿/瓶、无菌手术器械。

环境与试剂预处理：超净工作台紫外消毒 30 分钟，培养基、PBS 在 37水浴预热，消化酶按比例稀释（胰蛋白酶终浓度 0.25%，胶原酶 终浓度 0.1%-0.2%）。

二、核心培养步骤（酶消化法，最常用）

组织获取与清洗：无菌条件下分离呼吸道组织（气管、支气管黏膜），去除脂肪、血管等结缔组织，用含双抗的 PBS 反复冲洗 3-5 次，剪碎成 1-2mm³ 的组织块。

酶解消化：将组织块转入离心管，加入预温的消化酶混合液，37恒温摇床消化 30-60 分钟（期间每 10 分钟轻轻吹打 1 次），至组织块分散为单细胞悬液。

终止消化与过滤：加入等体积含血清的专用培养基终止消化，用 200 目细胞筛过滤，去除未消化的组织碎片。

离心纯化：过滤后的细胞悬液 1000rpm 离心 5 分钟，弃上清，用 PBS 重悬洗涤 2 次，再次离心后收集细胞沉淀。

接种与培养：用专用培养基重悬细胞，调整密度至 1×10-1×10 cells/mL，接种到铺有明胶（可选，增强细胞贴壁）的培养瓶/皿中，置于 37、5% CO培养箱中培养。

换液与传代：接种后 24 小时首次换液，去除未贴壁细胞；后续每 2-3 天换液 1 次，待细胞汇合度达 80%-90% 时，用胰蛋白酶消化传代（传代比例 1:2-1:3）。

三、关键注意事项

无菌操作：全程避免污染，所有器械、试剂需灭菌，操作时戴无菌手套、口罩。

消化控制：酶消化时间不可过长，避免损伤细胞；若组织较坚韧，可联合使用胰蛋白酶 + 胶原酶 。

培养基选择：必须使用上皮细胞专用培养基，避免用通用培养基（易导致细胞分化或凋亡）。

环境稳定：培养箱温度、CO浓度需恒定，培养基 pH 维持在 7.2-7.8，避免频繁开关培养箱。

四、常见问题解决

细胞贴壁差：提前用明胶或多聚赖氨酸包被培养皿，或在培养基中添加少量上皮细胞生长因子。

细胞污染：若出现细菌污染，可短期加入高浓度双抗（需后续更换正常培养基）；真菌污染需丢弃培养物，彻底消毒实验环境。

细胞增殖缓慢：检查培养基是否过期，补充适量胎牛血清（终浓度 5%-10%）或生长因子，确保培养环境无菌。

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