大鼠胚皮肤成纤维细胞的分离与培养方法及应用领域！

 

 

大鼠胚皮肤成纤维细胞（Rat Embryonic Skin Fibroblasts，简称 RESF）是从大鼠胚胎皮肤组织中分离培养的成纤维细胞，属于原代细胞或传代细胞系，在生物学研究中应用广泛。以下从细胞特性、分离培养方法、应用领域及注意事项等方面进行详细介绍：

 

一、细胞基本特性

 

1、来源与形态

 

来源于大鼠胚胎（通常选择 13-18 天龄胚胎，此时皮肤组织分化程度低，成纤维细胞活性高、增殖能力强）的皮肤真皮层。

 

形态呈长梭形或多角形，贴壁生长，细胞质丰富，细胞核明显，在显微镜下呈典型的成纤维细胞形态（类似“纺锤体”），排列具有一定方向性。

 

2、生物学功能

 

主要功能包括合成和分泌胶原蛋白、弹性纤维等细胞外基质成分，参与皮肤组织的构建、修复和再生。

 

具有较强的增殖能力和分化潜能（在特定诱导条件下可向肌成纤维细胞等方向分化），是研究细胞增殖、分化、凋亡及组织损伤修复的理想模型。

 

3、培养特性

 

属于贴壁依赖型细胞，需要附着在培养瓶 / 皿表面才能生长，传代时需用胰蛋白酶等消化酶处理使其脱离基质。

 

最适培养温度为 37，需要 5% CO的湿润环境以维持培养基 pH 稳定（通常 pH 7.2-7.4）。

 

对营养要求较高，常规使用含 10%-20% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 或 MEM 培养基。

 

二、分离与培养方法（原代培养）

 

1、材料准备

 

实验动物：13-18 天龄大鼠胚胎（无菌条件下获取）。

 

试剂：PBS 缓冲液（无钙镁离子）、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液、含 10% FBS 的 DMEM 培养基、青霉素 - 链霉素混合液（双抗）。

 

仪器：超净工作台、CO培养箱、倒置显微镜、无菌手术器械（剪刀、镊子）、培养皿、离心管等。

 

2、分离步骤

 

取材：无菌条件下取出大鼠胚胎，用预冷的 PBS 冲洗 3 次以去除血迹；剥离胚胎皮肤组织（避开毛发和皮下脂肪），剪成 1-2mm³ 的小块。

 

消化：将组织块转移至离心管，加入 5-10 倍体积的 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA，37水浴消化 20-30 分钟（期间轻轻摇晃）；消化结束后，加入等量含血清的培养基终止消化，用吸管轻轻吹打使细胞分散。

 

过滤与离心：用 200 目细胞筛过滤细胞悬液，去除未消化的组织碎片；1000rpm 离心 5 分钟，弃上清，用含双抗的完全培养基重悬细胞。

 

3、培养与传代

 

接种培养：将细胞悬液接种至培养瓶中，置于 37、5% CO培养箱中培养；24 小时后观察细胞贴壁情况，更换培养基以去除未贴壁细胞和碎片。

 

传代：当细胞汇合度达到 80%-90% 时进行传代。具体操作：弃去旧培养基，PBS 冲洗 2 次；加入适量胰蛋白酶 - EDTA，37孵育 2-5 分钟（镜下观察细胞变圆、脱落）；加入血清培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液；离心后重悬，按 1:2 或 1:3 比例接种至新培养瓶。

 

三、主要应用领域

 

1、皮肤生物学研究

 

研究皮肤创伤愈合机制：观察成纤维细胞在伤口修复中的迁移、增殖及基质合成过程。

 

探讨皮肤病发病机制：如银屑病、瘢痕形成中，成纤维细胞的异常活化与细胞外基质代谢失衡的关系。

 

2、药物筛选与毒性测试

 

评估化妆品、外用药物对皮肤细胞的毒性或刺激性（替代动物实验的体外模型）。

 

筛选促进伤口愈合或抑制瘢痕增生的候选药物。

 

3、细胞外基质研究

 

研究成纤维细胞合成胶原蛋白、透明质酸等基质成分的调控机制，以及基质与细胞信号通路的相互作用。

 

4、干细胞研究辅助模型

 

作为饲养层细胞支持胚胎干细胞或诱导多能干细胞（iPSC）的生长与分化（提供营养因子和细胞外基质微环境）。

 

四、培养注意事项

 

无菌操作：原代细胞分离和传代过程需严格无菌，避免污染（细菌、真菌或支原体污染会导致细胞死亡或功能异常）。

 

血清质量：胎牛血清的质量对细胞生长影响较大，建议选择批次稳定、经过筛选的血清（可提前做血清敏感性测试）。

 

传代时机：避免细胞过度汇合（超过 90%），否则会导致细胞形态改变、增殖能力下降；长期传代（如超过 10 代）可能出现细胞老化或表型漂移，实验需控制在早期传代阶段。

 

冻存与复苏：如需长期保存，可在细胞对数生长期冻存（冻存液含 10% DMSO+90% FBS），-80短期保存或液氮长期保存；复苏时 37水浴快速融化，离心去除 DMSO，避免其对细胞的毒性。

 

大鼠胚皮肤成纤维细胞因其来源稳定、培养难度较低且功能明确，成为皮肤组织工程、细胞生物学及药理学研究中的常用工具细胞，为相关领域的基础研究和应用开发提供了重要支持。

 

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