微生物实验室检测中应该如何判断菌种是否老化？

 

百欧博伟生物：判断菌种是否老化，需要结合形态学观察、生理生化指标检测、生长特性分析以及分子生物学方法进行综合评估。以下是一些关键的判断方法和指标：

 

一、形态学观察

 

1、菌落形态改变：

 

变小变薄：老化菌种的菌落通常比年轻菌落直径更小、更薄、更扁平，生长缓慢。

 

干燥或粘稠：表面可能变得干燥、皱缩，或者相反，变得异常粘稠、湿润。

 

颜色改变：色素产生可能减弱或消失（如放线菌、霉菌），或者产生异常色素。

 

边缘不规则：菌落边缘可能变得不整齐、锯齿状或扩散状。

 

产孢能力下降：对于能产生孢子（如芽孢杆菌、霉菌、放线菌）或分生孢子的菌种，老化后产孢量显著减少甚至完全不产孢，菌落看起来“光秃秃”。

 

2、细胞形态改变（显微镜观察）：

 

形态异常：细胞可能变大、变小、变长、变短、畸形（如出现梨形、膨大、分枝等异常形态）。

 

染色不均匀：革兰氏染色反应可能发生变化或染色不均匀。

 

出现空泡或颗粒：细胞内积累空泡、脂肪颗粒或其他内含物。

 

细胞壁/膜缺陷：可能观察到细胞壁变薄、破损或细胞膜通透性改变（可通过特定染料如台盼蓝、PI染色检测死细胞比例增加）。

 

自溶现象：出现大量细胞碎片。

 

二、生长特性分析

 

1、生长速度显著减慢：

 

延滞期延长：接种后适应新环境的时间大大增加。

 

对数生长期缩短且斜率降低：最大比生长速率显著下降。

 

达到稳定期的时间推迟：整体生长周期变长。

 

最终生物量降低：稳定期的细胞密度或菌丝干重明显低于正常水平。

 

2、液体培养特征：

 

浑浊度增加缓慢：OD值增长慢。

 

沉降性改变：细菌可能提前絮凝或沉降；真菌菌丝球可能变小、变疏松或不易形成。

 

上清液变化：可能变得更粘稠（如产多糖增加）或出现更多细胞碎片。

 

三、生理生化指标

 

1、代谢活性下降：

 

呼吸强度减弱：耗氧速率或CO2产生速率降低（可用溶氧电极、呼吸仪或CO2分析仪测量）。

 

ATP含量下降：细胞内ATP水平是反映细胞活力的直接指标，老化菌种ATP含量显著降低。

 

脱氢酶活性降低：TTC（氯化三苯基四氮唑）还原试验等检测脱氢酶活性的方法显示活性减弱（红色产物减少）。

 

关键酶活性降低：与生长和主要代谢途径相关的酶（如糖酵解、TCA循环、合成酶类）活性下降。

 

2、底物利用和产物合成能力改变：

 

碳源/氮源利用效率下降：对特定碳源或氮源的利用变慢。

 

目标产物产量显著降低：对于生产菌（如抗生素、酶、有机酸、溶剂），其合成目标产物的能力大幅下降甚至丧失，这是工业上判断老化的最重要指标之一。

 

副产物或异常代谢产物增加：可能产生一些非典型的代谢废物。

 

3、胁迫耐受性下降：

 

对环境压力更敏感：对温度、pH、渗透压、抗生素、有毒物质等的耐受性降低，更容易死亡。

 

四、分子生物学方法（更精确，常用于研究或重要菌种）

 

rDNA序列稳定性：极端老化或长期传代可能导致rDNA出现突变或缺失（虽然相对罕见）。

 

质粒稳定性：对于携带质粒的菌种，老化可能导致质粒丢失率增加。

 

基因表达谱改变：通过转录组学分析，可以发现与应激响应、能量代谢、蛋白质合成、细胞分裂等相关的基因表达发生显著变化。

 

蛋白质组学分析：可检测到应激蛋白、错误折叠蛋白、降解酶等表达水平的变化。

 

五、菌种保藏与传代的影响

 

频繁传代是导致老化的主要原因。每次传代都可能积累自发突变或表观遗传变化。

 

不恰当的保藏方法会加速老化：

 

斜面传代保藏：最容易老化，需严格控制传代次数（一般不超过3-5代）和保藏时间（1-3个月）。

 

矿物油覆盖保藏：比斜面稍好，但仍有老化风险。

 

冷冻保藏（-20， -80）：效果较好，但-20保藏时间不宜过长（数月到1年），-80可保藏数年。需要添加合适保护剂。

 

冷冻干燥保藏（冻干）：长期保藏（数年甚至数十年）的常用方法，能有效延缓老化。

 

液氮保藏：是目前公认最可靠的长期保藏方法，能最大程度保持菌种原始性状。

 

总结：如何综合判断？

 

常规监控：在实验室或生产过程中，最常用且有效的方法是定期监测菌种的生长曲线和关键产物产量。如果生长明显变慢、生物量降低、特别是目标产物产量持续显著下降，是菌种老化的强烈信号。

 

形态学检查：每次传代或使用前，观察菌落形态（大小、颜色、边缘、产孢情况）和细胞形态是快速简便的初步判断手段。

 

活力检测：结合TTC还原试验、平板计数存活率、显微镜观察死/活细胞染色等评估细胞活力。

 

保藏记录：严格记录菌种的传代次数、保藏方法和保藏时间。超过安全传代次数或保藏期限的菌种应高度怀疑老化，需进行复苏和性能验证。

 

对比参照：与已知年轻、活力旺盛的原始菌种或低代数保藏菌种进行平行实验对比，是最直接的判断方法。

 

核心原则：一旦观察到生长迟缓、形态异常、产孢减少、关键代谢产物产量持续显著下降等多项指标同时出现，就应高度怀疑菌种老化。此时需要复苏原始保藏菌种（低代数或冻干/液氮保藏株）进行替换，并优化保藏和传代策略以防止老化再次发生。

 

重要提示：在得出老化结论前，需排除其他干扰因素，如培养基成分变化、培养条件（温度、pH、溶氧）控制不当、污染、噬菌体感染等。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！