荧光标记抗体法的实验前准备与操作步骤及注意事项！

百欧博伟生物：荧光标记抗体法操作需分样本类型（细胞爬片/组织切片），核心是通过固定、封闭、孵育特异性抗体实现标记，以下是针对人小胶质细胞爬片的标准操作步骤，可根据样本调整细节。

一、实验前准备

材料准备：人小胶质细胞爬片、红色荧光标记的 Iba1 抗体、PBS 缓冲液（pH7.4）、4% 多聚甲醛（固定液）、0.3% Triton X-100（透化剂）、5% BSA（封闭液）、抗荧光淬灭封片剂、湿盒、移液器及耗材。

抗体稀释：按抗体说明书比例（通常 1:100-1:500），用 5% BSA 将红色荧光标记 Iba1 抗体稀释，避免反复冻融。

二、具体操作步骤（以细胞爬片为例）

1、细胞固定

取出培养好的小胶质细胞爬片，用 PBS 轻轻冲洗 2 次，每次 1-2 分钟，去除培养基残留。

加入 4% 多聚甲醛，室温固定 15-20 分钟（避免固定过久导致抗原丢失）。

固定后用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟，洗去固定液。

2、细胞膜透化（可选，看抗体类型）

若抗体识别的抗原位于细胞内，需加入 0.3% Triton X-100，室温透化 10-15 分钟，让抗体进入细胞。

透化后用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟，去除透化剂。

3、封闭非特异性结合

将爬片放入湿盒中，滴加 5% BSA 封闭液，完全覆盖细胞面，室温封闭 30-60 分钟（湿盒可防止液体蒸发，避免抗体干缩）。

封闭后无需冲洗，直接吸去多余 BSA 即可。

4、孵育红色荧光标记抗体

按稀释比例滴加红色荧光标记的 Iba1 抗体，确保覆盖所有细胞，放入湿盒中。

4孵育过夜（或室温孵育 2-3 小时，过夜可提升结合效率）。

5、洗去未结合抗体

孵育结束后，用 PBS 轻轻冲洗爬片 3 次，每次 5-10 分钟，彻底去除未结合的游离抗体（此步骤可减少背景荧光）。

6、封片与观察

取干净载玻片，滴加 1-2 滴抗荧光淬灭封片剂，将爬片细胞面朝下贴合封片剂，避免产生气泡。

用荧光显微镜观察，选择红色荧光通道（激发波长约 635nm，发射波长约 655nm），拍摄并记录结果。

三、关键注意事项

全程保持样本湿润：除固定、透化步骤外，其他操作需在湿盒中进行，防止抗体干燥导致非特异性结合。

抗体浓度控制：浓度过高会增加背景荧光，过低则标记不清晰，需严格按说明书预实验验证比例。

避光操作：红色荧光染料易淬灭，从孵育抗体开始到观察结束，需尽量避光。

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