游离生物素测定培养基配制过程中无菌化处理的操作要点！

 

百欧博伟生物：在游离生物素测定培养基的配制中，无菌化处理是核心环节之一，直接影响测定结果的准确性（避免杂菌污染导致的“假阳性生长”）。以下是无菌化处理的关键操作要点，涵盖器具灭菌、原料除菌、操作环境控制等全流程：

 

一、器具与容器的无菌化处理

 

1、玻璃器皿的灭菌

 

清洗要求：先用自来水 + 洗洁精去除油污和杂质，再用蒸馏水冲洗 3 次（避免残留洗涤剂抑制微生物生长），倒置沥干水分。

 

灭菌方式：采用干热灭菌（160-170，2-3 小时），适用于试管、锥形瓶、培养皿、移液管等。

 

注意：灭菌后需待烘箱自然冷却至 60以下再取出（避免骤冷导致玻璃器皿炸裂），放入无菌操作台备用。

 

替代方案：对不耐干热的塑料容器（如一次性培养皿、离心管），采用高压蒸汽灭菌（121，15 分钟），但需确认材质耐高温高压。

 

2、橡胶/硅胶制品的灭菌

 

如胶塞、硅胶管等，需先用蒸馏水煮沸 10 分钟去除表面杂质，再与玻璃器皿一同高压蒸汽灭菌（121，15 分钟），避免干热灭菌导致老化。

 

二、培养基成分的无菌化处理（分两类）

 

（一）耐高温成分：高压蒸汽灭菌

 

适用于葡萄糖、磷酸盐、无机盐等热稳定性强的成分（已混合成基础溶液）。

 

操作要点：

 

分装时，锥形瓶内溶液体积不超过瓶容积的 2/3（避免灭菌时溢出），瓶口用纱布 + 牛皮纸包扎（透气且防污染）。

 

灭菌参数：121，15 分钟（温度过高或时间过长会破坏葡萄糖的还原性，或导致磷酸盐沉淀）。

 

排气要求：灭菌锅需先排尽冷空气（冷空气残留会导致温度不达设定值），可通过“放气阀”先快速排气 3-5 分钟，再关闭阀门升压。

 

冷却处理：灭菌结束后，缓慢降压（避免降压过快导致溶液暴沸），待压力归零后打开锅盖，取出后置于无菌操作台附近，自然冷却至 45-50（避免温度过高破坏后续添加的热敏成分）。

 

（二）热敏性成分：过滤除菌

 

适用于维生素混合液（含硫胺素、核黄素等易被高温破坏的成分）、去生物素后的酪蛋白水解物（若预处理后浓度低、易降解）等。

 

操作要点：

 

滤膜选择：使用0.22 μm 孔径的混合纤维素酯膜或聚醚砜膜（可截留细菌、真菌等微生物，且耐水相溶液）。

 

过滤装置灭菌：将滤膜、滤杯、接收瓶组装后，先高压蒸汽灭菌（121，15 分钟），冷却后在无菌操作台内安装（戴无菌手套，避免手接触滤膜表面）。

 

过滤操作：

 

先将待除菌溶液倒入滤杯，打开真空泵，缓慢抽滤（避免流速过快导致滤膜破裂）。

 

若溶液黏稠（如维生素混合液），可先稀释后过滤，或分多次过滤。

 

保存：除菌后的溶液需立即加入冷却至 45-50的基础培养基中（避免长时间放置滋生污染），且全程在无菌操作台内操作。

 

三、无菌操作环境的控制

 

1、超净工作台的使用

 

提前 30 分钟开启紫外灯消毒（波长 254 nm，可杀灭表面微生物），同时打开风机通风（避免紫外残留对操作者的伤害）。

 

操作前，用 75% 酒精擦拭台面、双手及试剂瓶外壁（75% 酒精杀菌效果最佳，过高浓度会形成蛋白凝固层，影响渗透）。

 

避免在操作台内进行剧烈操作（如快速晃动、开关瓶塞），减少空气对流导致的杂菌飘落。

 

2、人员操作规范

 

穿无菌实验服、戴无菌手套和口罩（头发、口鼻是主要污染源），手套若接触非无菌区域需立即更换。

 

开盖时，瓶塞/瓶盖需倒扣在台面（避免内表面接触污染），操作完成后立即盖紧。

 

移液时，移液管尖端避免触碰瓶口、台面或其他非无菌物体，多余溶液不可倒回原瓶。

 

四、灭菌效果的验证

 

1、空白对照实验

 

取少量灭菌后的培养基（未接种指示菌），在 37培养箱中培养 24-48 小时，观察是否有菌落生长或溶液浑浊。

 

若无菌生长，说明灭菌合格；若有污染，需重新排查灭菌参数、操作过程或环境问题。

 

2、指示剂验证

 

对高压灭菌效果，可在灭菌锅内放置芽孢指示剂（如嗜热脂肪芽孢杆菌孢子），灭菌后培养观察是否存活（若全部死亡，说明灭菌彻底）。

 

五、特殊注意事项

 

避免“二次污染”：已灭菌的培养基若需分装到培养皿，需在培养基冷却至 50左右时操作（温度过高会烫死后续接种的指示菌，过低则提前凝固），且倾倒速度适中（避免气泡过多导致杂菌附着）。

 

及时使用：灭菌后的培养基需在 24 小时内使用（尤其含维生素的培养基，长期存放会因营养降解影响效果），若需暂存，需在 4冰箱密封保存，且不超过 3 天。

 

通过严格控制以上操作要点，可最大限度降低杂菌污染风险，确保培养基的无菌性，为游离生物素的准确测定提供基础。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！