猪原代骨骼肌成纤维细胞的分离与培养方法及应用领域！

 

猪原代骨骼肌成纤维细胞是从猪骨骼肌组织中直接分离获得的、未经过长期传代培养的成纤维细胞，保留了体内原有的生物学特性，是研究骨骼肌生理功能、损伤修复及相关疾病的重要体外模型。以下从多个方面详细介绍：

 

一、定义与来源

 

定义：原代细胞指从机体组织中首次分离并培养的细胞，未经过永生化或长期传代，生物学特性更接近体内状态；成纤维细胞是一类以合成细胞外基质（如胶原蛋白、弹性纤维）为主要功能的间质细胞，广泛存在于结缔组织中。

 

来源：主要取自猪的骨骼肌组织，通过酶解或组织块培养法分离得到，排除肌卫星细胞（骨骼肌干细胞）、肌纤维细胞等其他细胞类型后纯化获得。

 

二、生物学特性

 

1、形态特征

 

光镜下呈典型的长梭形或纺锤形，胞体扁平，细胞核呈椭圆形、位于细胞中央；

 

贴壁生长能力强，体外培养时多呈放射状或漩涡状排列，汇合后形成致密的单层细胞。

 

2、生长特性

 

增殖能力有限：原代细胞传代次数通常为 5-10 代，超过一定代数后会出现增殖停滞；

 

营养需求：依赖血清提供生长因子，常用培养基为 DMEM 或 RPMI-1640，需在 37、5% CO、饱和湿度的培养箱中培养；

 

对环境敏感：易受污染（细菌、真菌或支原体）、机械损伤或营养缺乏影响，导致形态改变或凋亡。

 

3、核心功能

 

合成细胞外基质：分泌胶原蛋白（ 型、 型）、纤维连接蛋白、透明质酸等，维持骨骼肌组织的结构完整性；

 

参与损伤修复：在骨骼肌损伤后，成纤维细胞增殖并迁移至损伤部位，通过分泌基质成分促进肉芽组织形成，为肌卫星细胞的增殖分化提供支架；

 

调控肌细胞功能：通过分泌细胞因子与肌卫星细胞、肌纤维细胞相互作用，影响肌肉再生与纤维化。

 

三、分离与培养方法

 

1、取材与预处理

 

选取健康仔猪（或特定日龄猪）的骨骼肌组织，无菌条件下剔除脂肪、筋膜及血管，用 PBS（含双抗）冲洗 3-5 次以去除血迹；

 

将组织剪成 1mm³ 左右的小块，继续用 PBS 清洗至液体澄清。

 

2、分离方法

 

酶消化法（常用）：

 

用 0.25% 胰蛋白酶或 型胶原酶（37）消化组织块 30-60 分钟，期间轻轻震荡；

 

加入含血清的培养基终止消化，1000r/min 离心 5 分钟，弃上清，沉淀用培养基重悬；

 

过 200 目细胞筛去除未消化的组织碎片，获得单细胞悬液。

 

组织块法：

 

将剪碎的组织块均匀铺于培养皿底部，加入少量培养基（仅覆盖组织块），37培养箱静置 24-48 小时；

 

待组织块贴壁后缓慢补充培养基，成纤维细胞会从组织块边缘迁移出来并增殖。

 

3、纯化与传代

 

原代培养中可能混杂少量肌卫星细胞（圆形、核大），可通过差速贴壁法纯化：成纤维细胞贴壁速度快（1-2 小时），肌卫星细胞贴壁较慢，可通过更换培养基去除未贴壁的肌卫星细胞；

 

当细胞汇合度达 80%-90% 时，用胰蛋白酶消化传代，按 1:2-1:3 比例接种至新培养皿。

 

四、鉴定方法

 

为确认细胞纯度及类型，需结合形态学与分子标志物检测：

 

形态学鉴定：通过倒置显微镜观察典型的梭形贴壁形态，排除圆形细胞或上皮样细胞。

 

免疫荧光染色：成纤维细胞特异性表达波形蛋白，不表达肌细胞标志物或上皮细胞标志物，通过荧光标记的抗体染色可验证。

 

功能验证：检测细胞分泌胶原蛋白的能力，或观察其在损伤模型中的迁移能力。

 

五、应用领域

 

1、骨骼肌生理与病理研究

 

作为体外模型研究猪肌肉发育（如基质合成对肌纤维形成的影响）、肌肉萎缩或纤维化机制（如慢性损伤后成纤维细胞过度增殖导致的瘢痕形成）。

 

2、畜牧兽医领域

 

研究猪肌肉疾病的发病机制，筛选调控肌肉品质的候选基因或药物；

 

优化猪原代细胞培养体系，为转基因猪或基因编辑猪的细胞模型构建提供基础。

 

3、生物医学转化

 

由于猪与人类的骨骼肌结构、生理功能高度相似，该细胞可替代人源细胞，用于人类肌肉损伤修复、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）等疾病的药物筛选；

 

作为组织工程种子细胞，与生物材料结合，构建人工肌肉组织。

 

六、注意事项

 

无菌操作是关键：原代细胞分离过程易受污染，需严格消毒器械、培养基及操作环境；

 

避免过度传代：超过 10 代后细胞可能出现形态改变或功能退化，实验需在早期传代（3-5 代）进行；

 

血清质量影响大：不同批次血清的生长因子含量差异可能导致细胞增殖效率波动，建议提前筛选并统一批次。

 

总之，猪原代骨骼肌成纤维细胞因保留了体内生物学特性，在农业科学与生物医学研究中具有不可替代的价值，其分离培养与功能研究为解析骨骼肌生理病理机制提供了重要工具。

 

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