细胞DNA残留对实验结果的影响分析及常见问题与解决方法！

 

百欧博伟生物：细胞DNA残留对实验结果的影响是分子生物学和细胞生物学实验中一个常见且严重的问题，尤其在涉及高灵敏度检测或需要纯核酸/蛋白质样本的实验中。其主要影响包括：

 

一、在核酸相关实验中的直接影响

 

1、假阳性结果 (False Positives):

 

PCR/qPCR: 这是最常见的也是最严重的影响。残留的DNA模板会被引物扩增，即使目标RNA或特定的DNA目标不存在，也会产生信号。这会导致对基因表达量、病原体存在、转基因状态等的错误判断。

 

测序 (NGS, Sanger): 残留DNA会被测序，污染最终的测序文库，导致：

 

引入非目标序列的读段，降低有效数据量。

 

产生嵌合序列。

 

干扰变异检测（如在RNA-seq中误将基因组变异当作转录本变异）。

 

在宏基因组研究中，污染宿主DNA会掩盖低丰度微生物信号。

 

分子克隆: 污染的背景DNA可能被错误地克隆到载体中。

 

2、定量不准确 (Inaccurate Quantification):

 

qPCR: 残留DNA会作为额外的“模板”被扩增，导致对目标RNA（cDNA）或DNA的定量值显著偏高。即使使用基因组DNA引物或设计跨内含子引物来区分，如果残留量很高，仍然会造成背景噪音升高，降低检测低丰度目标的灵敏度和准确性。

 

分光光度法/荧光法核酸定量: 残留DNA会贡献额外的吸光度（A260）或荧光信号，导致对目标RNA或纯化后DNA浓度的高估。

 

3、降低灵敏度和特异性 (Reduced Sensitivity and Specificity):

 

残留DNA增加了背景噪音，使得检测低丰度目标分子变得更加困难，有效灵敏度降低。

 

非特异性扩增或结合的风险增加，可能导致非目标条带或信号的出现（特异性降低）。

 

4、干扰酶反应 (Interference with Enzymatic Reactions):

 

在反转录反应中，残留的基因组DNA可能直接作为模板，绕过反转录步骤被后续PCR扩增（导致假阳性），或者与RNA竞争反转录酶和底物，降低RT效率。

 

一些酶（如限制性内切酶、连接酶、聚合酶）可能非特异性地作用于残留DNA底物，消耗反应组分，降低目标反应的效率。

 

二、在非核酸相关实验中的影响

 

1、蛋白质研究 (Western Blot, ELISA, 质谱等):

 

非特异性结合: 带负电的DNA片段可能与带正电的蛋白质或实验器具（如膜、微孔板）发生非特异性结合，增加背景噪音。

 

干扰抗原-抗体结合: DNA可能空间位阻或非特异性地结合抗体，影响目标蛋白的检测特异性和灵敏度。

 

质谱样品制备: DNA污染会降低肽段的分离效率，增加谱图复杂性，干扰蛋白质鉴定和定量。

 

2、细胞培养和功能实验:

 

激活免疫反应: 在某些细胞（尤其是免疫细胞）培养中，外源DNA片段可能被模式识别受体识别，激活干扰素通路等免疫反应，改变细胞的生理状态和实验结果。

 

非生理性刺激: 游离DNA可能对细胞产生非预期的刺激效应。

 

3、其他生化分析:

 

残留DNA可能干扰比色法或荧光法的读数（贡献背景信号）。

 

在需要极高纯度的样品（如结构生物学、代谢组学）中，任何杂质都可能影响结果的可重复性和准确性。

 

三、如何最小化DNA残留的影响

 

1、使用DNase I处理: 在RNA纯化过程中或纯化后，加入无RNase的DNase I 消化残留DNA是标准操作。处理后再进行充分的灭活和纯化去除DNase和消化产物。

 

2、优化纯化方案: 选择针对特定样本类型（血液、组织、细胞、FFPE等）优化的核酸提取试剂盒，这些试剂盒通常包含有效的DNA去除步骤。

 

3、精心设计引物/探针:

 

跨内含子设计: 对于RT-qPCR，将引物设计在目标基因的两个相邻外显子上，跨越一个内含子。这样，扩增cDNA产物较短，而扩增残留基因组DNA会产生更长的产物（如果内含子足够大），在qPCR溶解曲线或凝胶电泳上可以区分。

 

使用基因组DNA引物对照: 在RT-qPCR实验中设置一个不加反转录酶 (-RT) 的对照。该对照如果出现阳性信号，则明确指示存在DNA污染，且其Ct值可以提示污染程度。

 

4、严格的实验操作:

 

分区操作: 将样品制备区、PCR前区（加样区）、PCR后区（产物分析区）严格物理分隔，使用独立的移液器、耗材和实验服。

 

勤换枪头: 绝对避免交叉污染。

 

使用带滤芯的枪头: 防止气溶胶污染。

 

定期清洁: 使用DNA去除剂清洁工作台和仪器表面。

 

5、设置恰当的阴性对照:

 

无模板对照: 在PCR/qPCR中必须设置，监测试剂污染。

 

无反转录对照: 在RT-qPCR中必须设置，监测DNA残留污染。

 

提取空白对照: 在核酸提取过程中设置一个不含样本的“空白”提取流程，监测提取试剂和过程的污染。

 

四、总结

 

细胞DNA残留是实验误差的重要来源，尤其在敏感的分子检测中会导致假阳性、定量偏高、灵敏度特异性下降等严重后果，甚至可能干扰非核酸实验的结果。认识到其危害性，并在实验设计、样本处理和操作流程中主动采取预防和去除措施，是确保实验结果准确可靠的关键。忽视DNA残留问题，可能导致整个实验结论被推翻。 在进行任何下游分析（特别是PCR/测序）之前，评估DNA残留水平（例如通过-RT对照或凝胶电泳）是非常必要的质量控制步骤。

 

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