乳酸菌检验计数准确性的影响因素与核心控制及操作流程！

 

百欧博伟生物：乳酸菌检验计数的准确性直接影响对样品中乳酸菌数量的判断（如发酵食品品质、益生菌产品活性等），其结果受样品处理、操作流程、培养条件等多个环节影响。以下从关键环节拆解影响计数准确性的核心因素，并说明具体影响机制：

 

一、样品本身及预处理因素

 

样品的初始状态和预处理方式是计数的“起点”，直接决定后续操作的基础是否可靠。

 

1、样品新鲜度与储存条件

 

乳酸菌（尤其是活菌）对环境敏感，若样品储存不当（如温度过高、储存时间过长），会导致乳酸菌自然死亡或增殖（如发酵初期样品），使原始菌数偏离真实值。例如：冷藏的酸奶若室温放置超过 2 小时，乳酸菌可能因温度升高加速代谢死亡；

 

样品若存在腐败、污染（如混入大量杂菌），可能释放抑菌物质（如某些腐败菌的代谢产物），抑制乳酸菌生长，导致计数偏低。

 

2、样品匀质与分散效果

 

乳酸菌可能在样品中呈聚集状态（如在发酵乳中因蛋白网络包裹形成菌团），若匀质不充分（如未用均质器处理、匀质时间不足），会导致菌团未分散，单个菌落可能对应多个菌体，最终计数结果偏低。

 

对于固体 / 半固体样品（如奶酪、泡菜），若未按标准比例加入稀释液（如 1:9 无菌生理盐水）、未充分研磨或搅拌，会导致样品无法均匀分散，后续稀释液中菌浓度不均，接种后菌落数差异极大。

 

二、稀释与接种操作因素

 

稀释和接种是将样品中乳酸菌“定量传递”到培养基的关键步骤，操作不规范会直接导致菌数传递偏差。

 

1、稀释液选择与制备

 

稀释液需满足“不损伤乳酸菌、维持渗透压”的要求（常用无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液或 0.1% 蛋白胨水）。若稀释液渗透压过高（如未稀释的生理盐水）或含抑菌成分（如残留消毒剂），会导致乳酸菌在稀释过程中死亡，计数偏低；

 

稀释液未灭菌或灭菌不彻底（如污染杂菌），会引入外源菌，与乳酸菌竞争生长，甚至掩盖乳酸菌菌落，导致“假阳性计数”（偏高）。

 

2、稀释过程的均一性

 

稀释时若未严格遵循“每级稀释后充分混匀”（如未用涡旋振荡器振荡、仅简单摇晃），会导致稀释液中菌浓度分布不均：高浓度区域接种后菌落过密，低浓度区域菌落稀疏，最终计数结果波动极大（同一稀释度平行样差异超过允许范围）；

 

稀释倍数计算错误（如误将 1:10 稀释操作为 1:100）或吸管使用不当（如未使用刻度准确的移液管、移液时残留液体未完全释放），会直接导致稀释倍数偏差，最终结果成比例偏离真实值。

 

3、接种量与操作规范性

 

接种量需精准（常用 0.1mL 或 1mL 涂布 / 倾注），若接种量误差过大（如实际接种 0.08mL 却按 0.1mL 计算），会导致最终计数结果（菌落数 / 接种量 × 稀释倍数）偏高或偏低；

 

涂布接种时若培养基未凝固就涂布，会导致菌液渗入培养基深层，菌落难以长出；倾注接种时若培养基温度过高（如超过 50），会直接烫死乳酸菌，导致菌落数骤减（严重时为 0）。

 

三、培养基与试剂因素

 

乳酸菌对营养和环境敏感，培养基的“适配性”直接决定其能否正常生长形成可见菌落。

 

1、培养基营养与配方适配性

 

乳酸菌为化能异养菌，需特定碳源（如葡萄糖、乳糖）、氮源（如蛋白胨、酵母浸粉）及生长因子（如维生素、氨基酸）。若培养基营养不足（如酵母浸粉添加量不够）或碳源不适（如某些乳酸菌不能利用蔗糖，却用蔗糖作为唯一碳源），会导致乳酸菌生长缓慢或无法形成可见菌落，计数偏低；

 

培养基 pH 需适配乳酸菌生长（多数乳酸菌最适 pH 6.0-7.0，发酵型可能耐受更低 pH）。若 pH 过高（如未调 pH 导致碱性）或过低，会抑制乳酸菌增殖，菌落小且少，甚至无法计数。

 

2、培养基灭菌与储存

 

灭菌过度（如高压蒸汽灭菌时间过长、温度过高）会破坏培养基中的热敏成分（如维生素、某些氨基酸），导致营养失效；灭菌不彻底则会污染杂菌（如芽孢杆菌、酵母菌），杂菌菌落可能与乳酸菌菌落形态相似（如圆形、乳白色），导致误判为乳酸菌（计数偏高）；

 

培养基储存不当（如开封后未冷藏、储存时间过长）会吸湿结块或污染，使用时无法均匀溶解，或引入杂菌，影响菌落生长和判断。

 

四、培养条件因素

 

乳酸菌的生长依赖严格的温度、氧气、时间等环境条件，任何一项偏离都会导致菌落生长异常。

 

1、培养温度与时间

 

不同乳酸菌最适生长温度不同：乳杆菌属多为 30-37，链球菌属多为 35-39。若温度偏离（如将乳杆菌置于 40培养），会导致生长速率下降，培养相同时间后菌落未成熟（过小或不可见），计数偏低；

 

培养时间不足（如标准要求 48-72 小时，却仅培养 24 小时），乳酸菌未充分增殖形成可见菌落；时间过长则可能导致菌落过度生长、融合（尤其高浓度稀释度），无法区分单个菌落（少计），或杂菌大量繁殖掩盖目标菌落。

 

2、氧气环境控制

 

乳酸菌多数为兼性厌氧或微需氧（少数为严格厌氧，如双歧杆菌）。若培养时氧气浓度过高（如未用厌氧培养箱、厌氧袋，直接暴露于空气中），会抑制厌氧型乳酸菌生长（如双歧杆菌无法形成菌落），导致计数结果仅反映需氧 / 兼性厌氧菌株，遗漏厌氧菌株（整体偏低）；

 

厌氧环境控制不当（如厌氧袋失效、培养容器密封不严），氧气残留会导致部分乳酸菌生长受阻，菌落数量减少。

 

五、计数操作与判断因素

 

计数是结果输出的最后一步，主观判断和操作规范直接影响最终数值。

 

1、菌落形态判断准确性

 

乳酸菌菌落多为圆形、边缘整齐、乳白色或浅黄，表面光滑；但样品中若存在杂菌（如污染的微球菌、酵母菌），可能形成形态相似的菌落，若计数时未区分（如误将酵母菌菌落计入），会导致计数偏高；

 

部分乳酸菌因生长缓慢，菌落极小（如某些乳球菌），若计数时未注意观察（漏计小菌落），会导致结果偏低。

 

2、计数范围选择

 

标准要求选择菌落数在30-300 个的平板计数（此范围菌落分布均匀，计数误差小）。若选择菌落数＜30 的平板（误差率＞10%）或＞300 的平板（菌落重叠、难以区分），会导致结果偏差；

 

同一稀释度平行平板间菌落数差异过大（如超过 1 倍），未按标准舍弃异常平板（如因操作污染导致的菌落骤增），直接取平均值会引入误差。

 

3、计数人员操作规范性

 

计数时未按“蛇形路线”逐格计数，漏计边缘或角落菌落；或对融合菌落（如 2 个菌落相邻）未按“单个菌落”判断（多计）；

 

未使用 Colony Counter（菌落计数器）等工具，仅凭肉眼估算，导致主观误差（尤其菌落密集时）。

 

六、器具与环境因素

 

无菌环境和合格器具是避免“外源干扰”的基础。

 

1、器具无菌性

 

培养皿、移液管、试管等未彻底灭菌（如残留芽孢），会引入杂菌污染培养基，杂菌菌落与乳酸菌混淆，导致计数偏高；

 

器具清洗不彻底（如残留洗涤剂），会释放抑菌物质，抑制乳酸菌生长，导致菌落数减少。

 

2、操作环境洁净度

 

在非无菌环境（如未消毒的超净台、开放工作台）操作，空气中的杂菌（如霉菌、芽孢杆菌）会落入培养基，污染平板，干扰计数；

 

操作人员手部、衣物未消毒，或操作时说话、咳嗽，会引入外源菌，导致污染。

 

七、总结：核心控制逻辑

 

乳酸菌计数的核心是“让样品中所有活菌均能在培养基上形成可识别的单个菌落，并被准确计数”。因此，需从“样品保真→菌液均一传递→菌落正常生长→准确识别计数”全流程控制：

 

样品需新鲜、匀质充分；

 

稀释、接种需严格无菌、规范操作；

 

培养基和培养条件需适配目标乳酸菌；

 

计数时严格区分目标菌落、选择合理平板。

 

通过控制上述因素，可将计数误差控制在标准允许范围内（一般平行样相对偏差≤10%），确保结果可靠。

 

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