检测和鉴定细胞培养中真菌污染的具体操作步骤与方法！

 

百欧博伟生物：检测和鉴定细胞培养中的真菌污染，需结合形态观察、理化指标监测、特异性检测等方法，从“是否污染”到“污染真菌种类”逐步确认。不同阶段的检测目标不同：早期需快速判断“是否污染”，后续需精准鉴定“真菌类型”（为追溯污染源或选择处理方式提供依据）。以下是具体步骤和方法：

 

一、初步检测：快速判断是否存在真菌污染（适合日常筛查）

 

真菌污染在早期可能无明显肉眼可见变化，但通过形态观察和培养基指标监测可快速识别，尤其适合每日细胞巡检。

 

1、肉眼观察：识别典型污染特征

 

真菌污染的肉眼表现随种类和污染程度变化，可作为初步判断依据：

 

丝状真菌（如曲霉、毛霉）：污染 12-24 小时后，培养基表面或边缘会出现白色 / 绿色 / 黑色絮状菌落（菌丝聚集形成），悬浮培养时培养基会逐渐浑浊（呈棉絮状）；

 

酵母菌（如白念珠菌）：早期无明显絮状物，仅表现为培养基轻微浑浊（类似细菌污染，但浑浊度更低），后期可能形成白色颗粒状沉淀（酵母细胞聚集）；

 

培养基颜色变化：多数真菌代谢会产酸，导致含酚红指示剂的培养基从红色（pH7.2）逐渐变黄（pH<6.8），但速度慢于细菌污染（细菌污染可能 2-4 小时变黄）。

 

2、显微镜观察：确诊污染并区分真菌与其他污染源

 

肉眼疑似污染后，必须通过显微镜观察（40-100 倍物镜）确认，这是区分“真菌污染”“细菌污染”“细胞碎片”的关键：

 

丝状真菌：可见分支状菌丝（直径 2-10μm），部分菌丝有隔（如曲霉），部分无隔（如毛霉），菌丝可能缠绕细胞或漂浮在培养基中；

 

酵母菌：呈圆形 / 椭圆形单细胞（直径 5-10μm），比细菌大（细菌通常 1-2μm），可观察到出芽生殖（特征性“母子细胞相连”形态）；

 

3、与其他污染的区分：

 

细菌污染：显微镜下为大量细小点状颗粒（无菌丝），培养基浑浊更快（2-6 小时）；

 

细胞碎片：形态不规则、无运动性，且不会随培养时间增多。

 

操作技巧：观察时选择细胞密度较低的区域，避免细胞本身遮挡；若怀疑酵母菌污染，可滴加少量 0.1% 亚甲蓝染色（活菌不着色，死菌和真菌着色，更易区分）。

 

二、进阶鉴定：明确污染真菌的种类（适合追溯污染源或研究需求）

 

若需确定“污染真菌的具体种类”（如判断是来自培养箱、操作人员还是试剂），需通过培养分离和特异性鉴定方法，精度从“大类”到“菌株”逐步提升。

 

1、真菌分离培养：获得纯培养物

 

从污染的细胞培养体系中分离真菌，避免细胞和培养基成分干扰后续鉴定：

 

步骤：

 

取 100μL 污染的培养基，接种至真菌专用培养基（如 PDA 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，适合多数真菌生长；Sabouraud 培养基：含葡萄糖和蛋白胨，抑制细菌生长）；

 

28培养（真菌最适温度低于哺乳动物细胞），丝状真菌 1-3 天可见菌落，酵母菌 2-5 天可见菌落；

 

挑取单菌落（避免杂菌），转接至新培养基纯化（连续传代 2-3 次），获得纯培养的真菌。

 

2、形态学鉴定：基于菌落和显微特征（传统方法）

 

通过菌落形态（颜色、质地）和菌丝 / 孢子特征，可初步归类真菌种类，适合实验室快速鉴定：

 

真菌类型  菌落特征（PDA 培养基）  显微特征（染色后观察）

 

曲霉 圆形，表面有放射状纹理，颜色多样，背面黄色 菌丝有隔，分生孢子梗顶端呈“烧瓶状”，表面有链状孢子

 

毛霉 白色棉絮状，快速蔓延（1-2 天覆盖培养基），背面无色 菌丝无隔，孢子囊呈“球形”，生于直立菌丝顶端

 

酵母菌 圆形，光滑湿润，乳白色，边缘整齐 单细胞，圆形 / 椭圆形，可见出芽；部分有假菌丝

 

青霉 灰绿色，菌落边缘白色，质地绒状 菌丝有隔，分生孢子梗呈“帚状分支”，孢子链状排列

 

染色辅助：可用乳酸酚棉蓝染色（真菌细胞壁着色，背景透明），清晰观察菌丝和孢子结构。

 

3、分子生物学鉴定：精准到种（金标准）

 

若需明确具体“种”（如区分白念珠菌和热带念珠菌），或形态学难以判断时，通过基因测序鉴定：

 

目标基因：真菌的ITS 序列（内转录间隔区，位于 18S 和 28S rRNA 基因之间，种间差异大，保守性高）；

 

步骤：

 

从纯培养的真菌中提取基因组 DNA（用真菌 DNA 提取试剂盒，去除细胞壁）；

 

用 ITS 通用引物进行 PCR 扩增；

 

对 PCR 产物测序，将序列上传至数据库比对，匹配度≥97% 可确定种类。

 

4、其他辅助方法（根据需求选择）

 

生化鉴定：针对酵母菌，通过检测代谢能力（如碳源利用、酶活性）鉴定；

 

质谱鉴定：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，通过检测真菌的特征蛋白谱，与数据库比对（类似细菌鉴定），快速且精准，但依赖设备。

 

三、注意事项：避免检测过程中的二次污染或误判

 

区分“污染真菌”与“环境杂菌”：

 

检测时需同步做阴性对照（如未接种的 PDA 培养基，28培养），若对照也长出真菌，说明操作过程中引入环境杂菌（如空气、操作台污染），需重新分离；

 

细胞碎片的误判排除：

 

若显微镜下观察到“颗粒状物质”，可通过“运动性”判断：真菌（尤其酵母菌）可能有轻微布朗运动，而细胞碎片完全静止；也可通过染色（如台盼蓝），真菌细胞完整（不着色或浅着色），碎片无完整结构（深着色）；

 

早期微量污染的检测：

 

若怀疑“隐性污染”（细胞生长变慢，但无明显浑浊），可通过真菌特异性 PCR（直接以污染的细胞培养基为模板，扩增 ITS 序列），比培养法更灵敏（可检测到 10 个以下孢子）。

 

总结：检测与鉴定流程

 

初步筛查：每日观察细胞培养体系（肉眼看培养基浑浊度、颜色；显微镜看是否有菌丝 / 孢子）→ 确定是否污染；

 

分离纯化：若污染，接种至真菌培养基，获得纯培养物；

 

种类鉴定：

 

快速判断：形态学（菌落 + 显微特征）；

 

精准鉴定：分子测序（ITS 序列）或质谱；

 

结果应用：根据真菌种类追溯污染源（如曲霉多来自空气，酵母菌可能来自操作人员手部），并优化后续无菌操作。

 

通过以上步骤，可从“是否污染”到“污染何种真菌”形成完整判断，为后续处理（如丢弃污染样本、消毒培养环境）提供依据，避免污染扩散或实验数据失真。

 

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