筛选具有特定功能解淀粉芽孢杆菌的操作步骤与技术要点！

 

筛选具有特定功能的解淀粉芽孢杆菌菌株，核心是“定向取样→分离纯化目标菌→功能初筛→功能复筛→菌株鉴定→功能验证”的流程，关键在于根据“特定功能”设计针对性的筛选指标和方法。以下结合常见功能（如促生、生防、降解污染物等），详细说明筛选步骤和技术要点：

 

一、前期准备：明确“特定功能”与取样策略

 

筛选的前提是明确目标功能（如“促生”“抗某病原菌”“降解某污染物”等），并根据功能特性选择潜在含目标菌株的样品——样品中目标功能相关的环境压力（如养分缺乏、病原菌存在、污染物暴露）会富集对应功能的菌株。

 

目标功能  核心筛选指标  推荐样品来源

 

植物促生（溶磷/产激素） 溶磷能力、产吲哚乙酸能力等 健康作物根际土壤、植物根表（根际微生物更易促生）

 

生防（抗某病原菌） 对特定病原菌的拮抗能力 发病植物的健康组织附近（如病株根际、健康叶片）

 

降解污染物（如农药） 对目标污染物的降解率 长期受该污染物污染的土壤/水体（如农田、污水）

 

改善土壤（产胞外酶） 产淀粉酶、蛋白酶等酶活 富含有机质的土壤（如堆肥、腐殖土）

 

二、第一步：分离纯化解淀粉芽孢杆菌（排除杂菌干扰）

 

样品中含有大量微生物（如其他芽孢杆菌、真菌、革兰氏阴性菌等），需先通过选择性分离获得纯的解淀粉芽孢杆菌菌株，再进行功能筛选。

 

1、样品预处理：富集目标菌

 

解淀粉芽孢杆菌能形成芽孢（抗高温），可通过“热处理”淘汰非芽孢菌：

 

将样品（如土壤悬液）在 80-100水浴中处理 10-15 分钟（芽孢耐高温，营养体死亡），降低杂菌数量。

 

2、选择性培养基分离：利用解淀粉芽孢杆菌的特性

 

解淀粉芽孢杆菌能水解淀粉（核心特性），用淀粉培养基进行分离，通过“透明圈”初步识别：

 

培养基配方（示例）：淀粉 1%、蛋白胨 1%、牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、琼脂 2%（pH 7.0）。

 

操作：将预处理后的样品梯度稀释（10³~10），取 0.1mL 涂布平板，30-37培养 24-48h。

 

筛选：培养后在平板上滴加碘液（淀粉遇碘变蓝），周围出现透明圈的菌落即为“能水解淀粉的菌株”（解淀粉芽孢杆菌候选株）。

 

3、纯化菌株：获得单菌落

 

挑取透明圈明显的单菌落，通过“划线分离法”在相同培养基上连续传代 3-4 次，直至获得形态一致的单菌落（镜检确认无杂菌）。

 

三、第二步：功能初筛（快速淘汰无功能菌株）

 

根据目标功能设计定性或半定量的平板实验，快速筛选出“可能具有目标功能”的菌株（降低后续工作量）。

 

1、若目标功能为“植物促生”

 

核心是筛选“能提高养分有效性”或“产植物激素”的菌株，常用初筛方法：

 

溶磷能力初筛：用“无机磷培养基”（含难溶磷如磷酸钙），菌株周围出现透明圈（说明能溶解磷），透明圈直径（D）与菌落直径（d）比值越大，溶磷能力可能越强。

 

产 IAA（吲哚乙酸，植物激素）初筛：在含色氨酸的培养基中培养菌株，加入显色剂（显粉红色为阳性），颜色越深说明产 IAA 能力越强。

 

产铁载体初筛：用 CAS检测培养基，菌株周围出现橙色晕圈（铁载体结合铁，使蓝色培养基变色），晕圈越大说明产铁载体能力越强。

 

2、若目标功能为“生物防治（抗病原菌）”

 

核心是筛选“能抑制特定病原菌”的菌株，常用“拮抗实验”：

 

平板对峙法：在 PDA 或 NA 培养基中央接种病原菌（如镰刀菌、青霉菌），四周接种待筛菌株，30培养 3-5 天，观察菌株与病原菌之间是否出现“抑菌圈”（病原菌无法生长的空白区域），抑菌圈越大说明拮抗能力越强。

 

发酵液抑菌实验：将菌株发酵液过滤（去除菌体），取少量滴在含病原菌的平板牛津杯中，培养后观察牛津杯周围是否有抑菌圈（排除“竞争营养”干扰，验证是否产抑菌物质）。

 

3、若目标功能为“降解污染物（如农药、有机物）”

 

核心是筛选“能利用目标污染物作为碳源/氮源”的菌株，用“选择性培养基”初筛：

 

培养基以“目标污染物”为唯一碳源，接种待筛菌株后培养，若菌株能生长（形成菌落），说明可能降解该污染物。

 

进一步通过“显色反应”验证：若污染物可显色（如某些染料），菌株周围出现褪色圈，说明降解能力存在。

 

四、第三步：功能复筛（精确量化功能强度）

 

初筛仅能判断“有无功能”，复筛需通过定量实验测定功能强度，筛选出“高效功能菌株”。

 

1、促生功能复筛（以溶磷、产 IAA 为例）

 

溶磷量定量：将菌株接种到液体无机磷培养基，培养后离心取上清，用钼锑抗比色法测定上清中可溶性磷含量（单位：mg/L），计算溶磷率（溶磷量 / 初始总磷量 ×100%）。

 

IAA 产量定量：菌株在含色氨酸的液体培养基中培养，离心取上清，用显色剂显色后，通过分光光度计（530nm）测定吸光度，对比标准曲线计算 IAA 浓度（单位：μg/mL）。

 

2、生防功能复筛（以抑菌能力为例）

 

抑菌率定量：用“牛津杯法”测定抑菌圈直径，结合病原菌生长速率，计算抑菌率：抑菌率 =（对照组病原菌直径 - 处理组病原菌直径）/ 对照组病原菌直径 ×100%。

 

盆栽防效验证：在盆栽中接种病原菌和待筛菌株，观察植物发病程度（如病叶率、病情指数），计算防效：防效 =（对照组病情指数 - 处理组病情指数）/ 对照组病情指数 ×100%。

 

3、降解功能复筛（以农药降解为例）

 

降解率定量：将菌株接种到含目标农药的液体培养基，培养后通过气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）测定残留农药浓度，计算降解率：降解率 =（初始浓度 - 残留浓度）/ 初始浓度 ×100%。

 

降解速率测定：定时取样测定残留量，绘制降解曲线，筛选降解速率快（半衰期短）的菌株。

 

五、第四步：菌株鉴定（确认是解淀粉芽孢杆菌）

 

复筛获得的“高效功能菌株”需通过多方法鉴定，确保是解淀粉芽孢杆菌（避免其他芽孢杆菌干扰，如枯草芽孢杆菌）。

 

鉴定方法          核心指标

 

形态与培养特征   革兰氏阳性、杆状、产芽孢；淀粉培养基上有透明圈，菌落淡黄色、边缘不规则。

 

生理生化特性     能水解淀粉和明胶，V-P 试验阴性，硝酸盐还原阴性（与枯草芽孢杆菌区分）。

 

分子生物学鉴定   16S rRNA 基因测序（与已知解淀粉芽孢杆菌序列同源性≥99%）。

 

六、第五步：功能稳定性验证（确保应用潜力）

 

筛选出的菌株需验证功能稳定性——多次传代后，功能是否保持（避免因传代丢失功能基因）。

 

方法：将菌株连续传代 5-10 次，每次传代后测定核心功能指标（如抑菌率、降解率），若波动≤10%，说明稳定性良好。

 

总结：筛选核心逻辑

 

定向取样：利用环境压力富集目标功能菌株；

 

先分离后筛选：先通过淀粉水解特性分离解淀粉芽孢杆菌，再测功能（减少杂菌干扰）；

 

从定性到定量：初筛快速缩小范围，复筛精确量化功能；

 

结合鉴定与稳定性：确保菌株正确且功能可稳定遗传。

 

通过该流程，可高效筛选出具有特定功能的解淀粉芽孢杆菌菌株，为后续应用（如制成菌剂）奠定基础。

 

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