缓冲动力硝酸盐生化管的核心原理与使用方法及注意事项！

 

百欧博伟生物：缓冲动力硝酸盐生化管是一种用于微生物学检测的专用培养基，主要用于鉴定细菌是否具有还原硝酸盐（NO）为亚硝酸盐（NO）或进一步还原为氮气（N）或其他氮化合物的能力。这项检测是微生物鉴定（尤其是肠杆菌科和非发酵菌）中的一项重要生化试验。

 

一、核心原理：

 

提供硝酸盐底物：培养基中含有已知浓度的硝酸钾，作为细菌还原作用的底物。

 

提供营养与缓冲环境：培养基包含蛋白胨等营养物质，支持细菌生长。更重要的是，它含有缓冲系统（通常是磷酸盐缓冲液），这是名称中“缓冲动力”的来源。

 

缓冲作用：维持培养基pH相对稳定。细菌在代谢过程中可能产酸或产碱，缓冲液能中和这些变化，防止pH剧烈波动影响酶的活性或导致假阴性结果。

 

动力检测（间接）：“动力”在此处并非直接观察细菌运动性，而是指细菌在培养基中的生长扩散能力。该培养基是半固体形式（琼脂含量约为0.3%-0.4%）。具有鞭毛能运动的细菌，可以从穿刺线向四周扩散生长（呈云雾状或弥漫性生长）；无鞭毛不能运动的细菌，则主要沿穿刺线生长（呈线状生长）。生长模式有助于辅助鉴定。

 

检测亚硝酸盐（初步还原）：

 

如果细菌能将硝酸盐（NO）还原为亚硝酸盐（NO），当加入检测试剂（通常是对氨基苯磺酸和α-萘胺的混合液，称为硝酸盐试剂或格里斯试剂）后，NO会与试剂反应生成红色偶氮化合物（重氮反应）。这是阳性反应（+），表明细菌具有还原NO到NO的能力。

 

检测氮气或其他产物（完全还原）：

 

有些细菌不仅能把NO还原为NO，还能进一步将NO还原为氮气（N）、一氧化二氮（NO）、氨（NH）等其他氮化合物。这些产物无法与格里斯试剂反应显红色。

 

锌粉验证：如果在加入格里斯试剂后不显红色（阴性反应），需要添加锌粉进行验证。

 

锌粉的作用：锌粉是一种强还原剂。如果培养基中仍有未被细菌还原的硝酸盐（NO）存在，锌粉能将其化学还原为亚硝酸盐（NO）。

 

结果判读：

 

加入锌粉后显红色：说明原始培养基中仍有NO存在，细菌没有还原它（即细菌硝酸盐还原试验阴性）。

 

加入锌粉后仍不显红色：说明原始培养基中的NO已被细菌完全还原成了NO以外的其他产物（如N）。这是阳性反应（+），表明细菌具有将硝酸盐完全还原（或称“彻底还原”）的能力。

 

二、使用方法：

 

接种：

 

用无菌接种针挑取待测细菌的纯培养菌落。

 

以穿刺方式接种到缓冲动力硝酸盐生化管的培养基中，穿刺深度约为管深的1/3到1/2。

 

注意：穿刺后，沿原穿刺路径小心将针抽出，避免过度搅动培养基。

 

培养：

 

将接种后的生化管置于合适的温度（通常为35-37°C）下进行有氧培养。

 

培养时间一般为18-24小时。某些生长缓慢的菌株可能需要培养至48小时。

 

观察动力：培养后，首先在光线充足处观察细菌的生长模式：

 

沿穿刺线生长（线状）：通常表示无动力（不运动）。

 

从穿刺线向四周扩散生长（云雾状、弥漫状）：通常表示有动力（运动）。

 

检测硝酸盐还原（加试剂）：

 

取出培养后的生化管。

 

向管内加入硝酸盐还原试剂A（对氨基苯磺酸）和硝酸盐还原试剂B（α-萘胺）各4-5滴。

 

轻轻摇动试管，使试剂与培养基充分混合。

 

立即（通常在1-2分钟内）观察颜色变化：

 

出现红色或粉红色：阳性（+）。表明细菌将硝酸盐还原成了亚硝酸盐。

 

无颜色变化（保持试剂颜色或培养基原色）：暂定阴性。需要进行下一步验证。

 

验证试验（加锌粉 - 仅当第3步不显色时进行）：

 

向未显色的试管内加入少量锌粉（约一接种环的量）。

 

再次轻轻摇动试管。

 

立即（通常在1-2分钟内）观察颜色变化：

 

出现红色或粉红色：阴性（-）。锌粉将残留的硝酸盐还原为亚硝酸盐，证明细菌本身没有还原硝酸盐。

 

仍无颜色变化：阳性（+）。表明细菌已将硝酸盐完全还原成了亚硝酸盐以外的产物（如N），因此即使加入锌粉也无硝酸盐可供还原显色。

 

三、结果总结：

 

加入试剂A+B后的颜色 加入锌粉后的颜色 结果判读 意义

 

红色/粉红色         无需加锌粉       阳性 (+) 细菌将硝酸盐还原成亚硝酸盐

 

无颜色变化          红色/粉红色      阴性 (-) 细菌未还原硝酸盐

 

无颜色变化          无颜色变化       阳性 (+) 细菌将硝酸盐完全还原成其他产物（如N）

 

四、注意事项：

 

无菌操作：接种和加试剂时务必遵守无菌操作规程。

 

试剂质量与保存：硝酸盐试剂（A和B）应新鲜配制或按要求保存（通常避光冷藏），避免失效。锌粉应干燥保存。

 

立即观察：颜色反应（特别是加入锌粉后）应在规定时间内（1-2分钟）观察，放置过久颜色可能消退或出现非特异性反应。

 

培养时间：确保足够的培养时间。培养不足可能导致假阴性。对于生长缓慢的细菌，应延长培养时间至48小时后再检测。

 

对照试验：建议每次试验时同时设置已知阳性菌（如大肠埃希菌）和已知阴性菌（如醋酸钙不动杆菌）作为对照，以确保试剂和培养基有效，操作正确。

 

试剂添加顺序：必须先加A液再加B液，或者使用A/B混合液。

 

安全：α-萘胺有潜在致癌性，操作时应戴手套，在通风橱或安全环境下进行。浓盐酸（有时用于配制试剂）具有强腐蚀性，需小心操作。

 

动力观察：观察动力时，轻轻拿起试管，避免剧烈晃动破坏生长模式。最好在透光良好的背景下观察。

 

五、应用：

 

该试验广泛用于临床微生物实验室、环境微生物检测、食品和水质检测等领域，是鉴定以下细菌的重要指标之一：

 

肠杆菌科：区分不同属种（如大肠埃希菌通常阳性，克雷伯菌属、变形杆菌属等也多为阳性；沙门菌属、志贺菌属等多为阴性或复杂）。

 

非发酵革兰阴性杆菌：如铜绿假单胞菌（通常阳性，且常表现为完全还原产气）、不动杆菌属（通常阴性）、假单胞菌属其他种等。

 

厌氧菌：某些厌氧菌鉴定方案中也包含硝酸盐还原试验。

 

其他细菌：如奈瑟菌属、嗜血杆菌属等。

 

通过结合动力观察和硝酸盐还原结果（是否产亚硝酸盐或完全还原），可以更准确地辅助细菌的鉴定。

 

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