细胞培养实验中避免细胞系交叉污染的预防策略和实践指南！

 

百欧博伟生物：避免细胞系交叉污染是细胞培养实验中最关键的质量控制环节之一，一旦发生，会彻底摧毁实验结果的可靠性、可重复性和科学性。交叉污染通常是由于操作不当导致一种细胞意外混入另一种细胞的培养体系中，最终导致培养物被错误细胞完全取代。以下是一套综合性的预防策略和实践指南：

 

一、严格的实验室操作规范 (核心防线)

 

1、"一种细胞，一个区域，一个时间段"原则:

 

物理分隔：如果可能，为不同细胞系（尤其是易污染者）指定不同的生物安全柜或工作区域。

 

时间分隔：每次只处理一种细胞系。处理完一种细胞后，彻底清洁工作区、移液器表面、手套等，再进行下一种细胞的操作。避免同时打开多种细胞的培养瓶。

 

专用设备：为关键细胞系（或高风险系）配备专用移液器、吸头盒、培养瓶、试剂瓶等。

 

2、清晰无误的标记:

 

在培养瓶/皿、冻存管、试剂瓶上立即、清晰、完整地标记细胞系名称、代次、日期、操作者姓名。使用防水笔或专用标签。

 

避免将不同细胞系的瓶子放在一起，以免混淆。

 

在实验记录本上详细记录操作步骤和细胞信息。

 

3、无菌操作技术强化:

 

移液器使用：绝对避免移液器吸头接触任何非目标液体（如其他培养瓶内壁、瓶盖内面、工作台面）。每次吸液更换新吸头。定期对移液器进行表面消毒。

 

试剂分装：培养基、胰酶、PBS 等试剂应分装成小份，专瓶专用于特定细胞系。绝对避免将移液器/吸管直接插入主试剂瓶中吸取，应倒出所需量到无菌容器中使用。主试剂瓶应保持专用或严格管理。

 

瓶盖管理：打开培养瓶或试剂瓶时，瓶盖应内面朝上放置在无菌区域（如用酒精擦拭过的纸巾上），避免接触台面。操作完成后立即盖紧。

 

避免产生气溶胶：操作时动作轻柔，避免剧烈摇晃、吹打产生过多气泡和气溶胶（气溶胶是交叉污染的重要途径！）。

 

手套管理：频繁更换手套，尤其是在接触不同细胞系之间。接触可能污染的表面（门把手、电话、电脑）后必须更换手套或彻底消毒后才能继续细胞操作。

 

4、培养基和添加剂专用化: 尽可能为每种细胞系配制和使用其专用的完全培养基。如果需要添加抗生素或其他添加剂，确保操作过程无菌且专用。

 

二、建立和使用细胞库体系

 

1、主细胞库和工作细胞库：

 

主细胞库：在细胞引入实验室后，尽快扩增并冻存足够量的早期代次细胞。这些细胞仅用于复苏建立工作库或珍贵实验。

 

工作细胞库：从主库复苏细胞，扩增后再次冻存一批细胞。日常实验使用工作库的细胞。

 

定期回补：工作库细胞使用一定时间或一定代次后，丢弃旧的工作库，从主库复苏细胞重新建立新的工作库。

 

2、冻存管理：

 

冻存前确保细胞状态良好且经过鉴定。

 

清晰标记冻存管（名称、代次、日期、冻存液、操作者）。

 

使用程序降温盒或程控降温仪。

 

储存在液氮气相中（避免交叉污染风险最高的液相储存）。

 

冻存盒/架清晰标记，不同细胞系分区存放。

 

三、定期进行细胞系鉴定 (金标准)

 

1、STR 分析：这是目前国际公认的、最准确可靠的细胞系鉴定方法。它通过检测细胞基因组中多个短串联重复序列位点的等位基因图谱来建立细胞的"DNA指纹"。应：

 

入库必检：任何新引入的细胞系，在建立主细胞库前必须进行STR鉴定。

 

定期检测：工作细胞库的细胞在复苏使用前，以及连续传代过程中（建议每2-3个月或传代10-15次后）都应进行STR鉴定。

 

怀疑即检：如果细胞形态、生长速度等发生异常变化，或实验结果出现无法解释的异常，立即进行STR检测。

 

比对数据库：将STR图谱与国际标准数据库中该细胞系的参考图谱进行比对。同时也可与实验室保存的该细胞系早期图谱比对。

 

2、同工酶分析：通过电泳检测细胞中特定酶的异构体模式，可以区分不同物种来源的细胞。是STR分析的有力补充。

 

3、种属特异性检测：如PCR检测种属特异性基因片段，快速判断是否有异种污染。

 

4、形态学观察：虽然不能作为鉴定依据（形态会变），但熟悉细胞的正常形态是发现异常（如突然出现形态迥异的细胞）的第一道警报。

 

四、良好的实验室管理和培训

 

1、专人负责：指定人员负责细胞库的管理、维护、鉴定和发放。

 

2、严格记录：建立完善的细胞系档案，包括来源证明、鉴定报告、传代记录、冻存记录、使用记录等。

 

3、共享规范：实验室内部共享细胞系时，必须附带最新的鉴定报告。接收外部细胞系时，要求提供来源和鉴定信息，并自行复核。

 

4、人员培训：所有接触细胞培养的人员必须接受严格的无菌操作培训和交叉污染风险意识教育，并通过考核。强调遵守SOP的重要性。

 

5、清洁消毒：定期彻底清洁消毒生物安全柜、培养箱、工作台面、水浴锅、离心机等设备。培养箱内的水盘要定期清洁消毒并更换无菌水。

 

6、警惕"问题"细胞系：对已知易污染他系或易被污染（如一些生长缓慢的细胞）的细胞系要格外小心，实施更严格的隔离和操作措施。

 

关键要点总结

 

隔离与专用化：空间、时间、试剂、耗材尽可能专用。

 

无菌操作是根本 每一个动作都要考虑到避免污染的可能性（特别是气溶胶和移液器污染）。

 

标记清晰无误：这是防止人为混淆的基础。

 

建立并使用细胞库：这是保证细胞来源一致性和降低长期传代风险的核心策略。

 

定期STR鉴定是金标准：绝对不能仅凭形态、生长特性或来源信息就认为细胞没问题。必须进行分子水平的定期鉴定。

 

提高意识，严格管理：交叉污染是实验室管理不善和操作者意识薄弱的直接后果。需要整个团队的高度重视和执行力。

 

记住：预防交叉污染的成本（时间、金钱）远低于污染发生后的代价（实验失败、论文撤稿、声誉损失）。把细胞鉴定和规范操作作为实验不可分割的一部分，而非额外的负担。

 

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