微生物实验中接菌后平板上无菌生长的原因分析与排查！

 

百欧博伟生物：实验中遇到平板无菌生长的问题，是微生物实验中非常常见的现象，只要系统排查就能找到原因。下面详细分析一下可能的原因及解决方法。

 

一、菌种/接种物本身的问题 (这是最常见的原因之一)

 

1、菌种无活性/死亡:

 

保存不当: 菌种保存时间过长、保存温度不合适（如应冷冻的放冷藏）、反复冻融、冻干菌种复苏不当。

 

传代过多: 菌种连续传代次数过多，导致活力下降或变异。

 

污染或竞争: 原始菌种被杂菌污染，目标菌被抑制；或者菌种老化死亡。

 

处理不当: 接种前对菌种进行了不当处理（如高温、强酸强碱、消毒剂接触、剧烈震荡、离心速度过大等）。

 

2、接种物浓度过低:

 

取菌量太少，或稀释过度，导致平板上接种的活菌数量低于检测限。

 

菌悬液未混匀，取到的部分不含或含很少菌体。

 

3、使用了错误的菌种:

 

误用了非活菌（如灭活菌苗、死菌悬液）。

 

标签错误，接种的并非目标菌种。

 

4、接种物未正确准备:

 

冻干菌种未按规定程序复苏活化。

 

从甘油管或斜面取菌时未充分刮取菌苔。

 

二、培养基的问题

 

1、培养基成分不适宜:

 

培养基配方错误，缺乏目标菌生长必需的营养物质（碳源、氮源、生长因子、无机盐等）。

 

使用了选择性培养基，其含有的抑制剂（如抗生素、染料、胆盐、高盐等）恰好抑制或杀死了目标菌。

 

pH值不适宜：培养基灭菌后pH值偏离目标菌最适范围过多。

 

2、培养基失效:

 

培养基过期。

 

配制后储存时间过长或条件不当（如未冷藏、光照）导致成分降解或脱水。

 

反复加热熔化琼脂导致营养成分破坏。

 

3、培养基制备或灭菌不当:

 

灭菌不彻底：存在抑制目标菌生长的残留消毒剂或污染物产生的毒素。

 

过热破坏: 高压灭菌温度过高、时间过长，或倒平板时培养基温度过高（烫死接种物），特别是对热敏感的菌种。

 

琼脂浓度过高：影响菌的扩散和生长。

 

未充分溶解或混匀：营养成分分布不均。

 

4、未进行无菌测试: 培养基在接种前未进行无菌测试（空白培养），可能自身就无菌或含抑制剂。

 

三、接种操作的问题

 

1、未真正接到菌:

 

接种环/针/枪头未接触到菌种（如刮取斜面时没碰到菌苔，或取液体培养物时未插入液面下）。

 

接种环灼烧后未充分冷却，烫死了待接的菌。

 

涂布时涂布棒未冷却或用力过大将菌压入琼脂内甚至压死。

 

2、接种量损失:

 

划线时第一区划得太重或太多，大部分菌都留在第一区，后面区域无菌或菌极少。

 

倾注法混匀时琼脂温度过高烫死菌，或摇动过于剧烈产生气泡影响观察（但通常仍有菌生长）。

 

涂布时液体未吸收，菌悬液聚集在局部，或被涂布棒带出平板外。

 

3、污染导致抑制: 接种操作过程中引入的杂菌（如操作环境不洁、超净台/生物安全柜失效、操作者不熟练）过度生长，抑制了目标菌的生长（可能看到杂菌菌落，但无目标菌落）。

 

四、培养条件的问题

 

1、温度不适宜: 培养箱温度设置错误、温度不均匀、温度计不准、培养过程中断电或开门频繁导致温度波动过大，偏离目标菌的最适生长温度。

 

2、气体条件不适宜:

 

需氧菌: 培养容器（如厌氧罐、气密袋）未提供足够氧气；培养箱/罐内湿度过高导致冷凝水淹没平板表面，阻隔氧气。

 

厌氧菌: 未能创造有效的厌氧环境（厌氧罐/袋未正确抽气充气、厌氧指示剂未显示厌氧状态、催化剂失效、密封不严漏气）；培养基中未添加还原剂。

 

微需氧菌/CO2依赖菌: 未提供所需的特殊气体环境（如5-10% CO2）。

 

3、湿度不足: 培养箱内湿度过低，导致平板内培养基过早干燥脱水，菌无法生长（尤其是靠近边缘部分）。培养时间过长时更易发生。

 

4、培养时间不足: 某些菌种生长缓慢（如分枝杆菌、某些真菌），需要更长的培养时间（数天甚至数周）才能形成肉眼可见的菌落。在预期时间内观察可能看不到生长。

 

5、光照: 某些对光敏感的菌种在不当光照条件下生长受抑制（相对少见）。

 

五、其他原因

 

1、平板污染: 平板在储存或操作过程中被意外灭菌或污染了杀菌剂。

 

2、观察错误:

 

菌落非常微小、透明或与培养基颜色相近，肉眼难以辨别（需仔细检查或借助放大镜）。

 

菌落生长在琼脂内部（穿刺接种时常见）或平板底部（倒置培养时），未从表面观察。

 

误将沉淀、气泡或培养基杂质当作无菌生长。

 

3、目标菌的特性: 某些菌在特定条件下（如处于活的非可培养状态）无法在标准培养基上形成菌落。

 

如何排查和解决？

 

1、确认菌种活性:

 

同时接种另一种已知生长良好的非选择性培养基。如果该平板上也不长，则问题很可能在菌种本身或接种操作。

 

将原始菌种或接种物进行革兰氏染色镜检，观察是否有菌体存在（即使死的也能看到）。如有菌体但平板上不长，说明菌可能死了或培养基/条件不合适。

 

检查菌种来源、保存条件和记录。

 

2、确认培养基和培养条件:

 

设置培养基无菌测试对照: 未接种的同一批平板（或斜面/液体）放在相同条件下培养，应无菌生长。若对照长菌，说明培养基灭菌不彻底或操作污染严重。

 

设置阳性对照: 使用已知活性良好的同种或类似菌株（最好是标准菌株），在同一批培养基、相同条件下接种培养。如果阳性对照生长良好，说明培养基和培养条件基本没问题，问题在特定菌种或接种物。如果阳性对照也不长，则问题在培养基或培养条件。

 

仔细核对培养基配方和制备记录。

 

检查培养箱: 用经过校准的温度计多点验证箱内实际温度（尤其是平板放置的位置）。检查湿度（必要时放置水盘）。检查气体环境（CO2浓度、厌氧指示剂状态）。

 

延长培养时间: 对于生长缓慢的菌种，延长培养时间并在不同时间点观察。

 

3、审视接种操作:

 

确保接种工具充分灭菌并冷却。

 

确保取到了菌（肉眼观察接种环/针上是否有菌苔或浑浊）。

 

规范操作（划线法、涂布法、倾注法），避免接种量损失。

 

在超净台/生物安全柜内规范操作，减少污染风险。

 

4、系统性地排除: 从菌种开始，逐步检查接种物准备、培养基选择与制备、接种操作、培养条件设定等每一步骤。记录所有操作细节，便于回溯分析。

 

总之，平板无菌生长是一个多因素导致的结果。最有效的策略是设置严格的对照实验（无菌对照、阳性对照），并系统地检查菌种、培养基、操作和培养条件这四个关键环节。

 

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