菌种芽孢培养基的分类与原理及使用方法与操作流程！

 

菌种芽孢培养基的原理和使用方法主要围绕着诱导特定细菌从营养细胞状态转变为芽孢状态这一核心目标。芽孢是细菌在不利环境下形成的休眠体，具有极强的抗逆性（耐热、耐干燥、耐化学消毒剂等）。在实验室研究或工业生产中，常需要获得高纯度和高活性的芽孢。

 

一、原理

 

芽孢形成是一个复杂的分化过程，受多种环境信号触发。芽孢培养基的设计原理就是模拟或创造触发芽孢形成的环境条件，主要包括：

 

1、营养限制/饥饿：这是最主要的触发因素。当细菌生长所需的关键营养元素（特别是碳源、氮源或磷源）耗尽时，营养细胞会启动芽孢形成程序。因此，芽孢培养基通常是：

 

营养贫瘠型：相对于营养丰富的生长培养基，芽孢培养基的碳源、氮源等浓度显著降低。

 

营养不平衡型：提供过量的碳源但限制氮源，或反之，造成营养失衡。

 

不含快速利用碳源：避免快速代谢产生的丰富能量延缓芽孢启动。

 

2、高细胞密度：高密度的细胞群体本身会产生信号分子，促进群体同步进入芽孢形成阶段。因此，通常需要先在高营养培养基中进行预培养，获得高浓度的营养细胞，再接种到芽孢培养基中。

 

3、特定离子/微量元素：某些离子对芽孢的形成、成熟和稳定性至关重要。一些经典的芽孢培养基会特意添加这些离子。

 

4、好氧/厌氧条件：需氧芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌）需要氧气进行芽孢形成，而厌氧梭菌则需要在严格无氧条件下进行。

 

5、pH 和渗透压：维持适当的pH范围（通常中性附近）和渗透压有利于芽孢形成过程。

 

二、常用芽孢培养基

 

1、Schaeffer 培养基：最经典且广泛用于枯草芽孢杆菌等需氧芽孢杆菌。其原理基于营养限制（低氮源）和提供关键离子（Mn²）。

 

成分示例（每升）：

 

营养肉汤（Difco） 8g (提供基础营养，但浓度远低于LB)

 

KCl 1g

 

MgSO·7HO 0.25g

 

Ca(NO) 0.1g (或 CaCl 0.1g)

 

MnCl·4HO 0.01g (关键！促进芽孢形成)

 

FeSO·7HO 0.01mg (微量)

 

葡萄糖 0.5g (限制性碳源)

 

pH 调至 7.0 - 7.4

 

原理体现：相对低浓度的营养肉汤和葡萄糖造成营养限制，Mn²是关键诱导因子。

 

2、DSM 培养基：常用于工业生产或特定菌株。

 

成分示例（每升）：

 

胰蛋白胨 5g

 

酵母提取物 2.5g

 

KHPO 1g

 

葡萄糖 1g (限制性碳源)

 

MgSO·7HO 0.2g

 

MnSO·HO 0.05g (关键！)

 

CaCl 0.1g

 

pH 7.0 - 7.2

 

原理体现：较低浓度的碳氮源，添加Mn²。

 

3、G 培养基：也常用于枯草芽孢杆菌。

 

成分示例（每升）：

 

酵母提取物 0.5g

 

蛋白胨 0.5g

 

葡萄糖 1g

 

(NH)SO 0.2g

 

MgSO·7HO 0.2g

 

KCl 1g

 

MnSO·HO 0.05g (关键！)

 

CaCl 0.1g

 

FeSO·7HO 0.01mg

 

pH 7.0 - 7.2

 

原理体现：极低浓度的氮源（酵母+蛋白胨总量仅1g/L），添加Mn²。

 

强化梭菌培养基：用于产气荚膜梭菌、艰难梭菌等厌氧芽孢菌。通常以营养丰富的肉汤为基础，但关键是通过预还原和严格的厌氧培养环境（厌氧罐/厌氧工作站）来创造诱导芽孢形成的厌氧条件。有时也通过添加特定物质或调节pH来促进某些梭菌的芽孢形成。

 

三、使用方法（通用流程，以需氧枯草芽孢杆菌在培养基为例）

 

1、预培养（获得营养细胞）：

 

从新鲜平板上挑取单菌落，接种到 营养丰富的液体培养基（如 LB 肉汤） 中。

 

在 适宜生长温度（如37°C） 下，剧烈振荡（200-250 rpm） 培养 过夜（约16-18小时），使细菌达到对数生长晚期或稳定期早期（高细胞密度，约10 - 10 CFU/mL）。

 

2、接种芽孢培养基：

 

将 预培养物按一定比例（通常1-5%，体积比）接种到新鲜、灭菌的芽孢培养基中。

 

目的：确保芽孢培养基起始细胞密度足够高，利于群体感应和同步化。

 

3、诱导培养（芽孢形成）：

 

将接种后的芽孢培养基置于 适宜温度（通常同生长温度，如37°C） 下。

 

进行 剧烈振荡（200-250 rpm） 培养，保证充分通气（对需氧菌）。

 

培养时间：这是关键步骤，需要优化确定。通常需要 24-72小时 甚至更长。芽孢形成是一个多阶段的耗时过程（形成、成熟、释放）。可以通过显微镜（芽孢染色）定期观察芽孢形成比例来判断最佳收获时间。当显微镜视野下芽孢比例达到90%以上（营养细胞几乎消失）时为佳。

 

4、收获与纯化（可选，但常做）：

 

离心：将培养液离心，弃上清。沉淀为芽孢和少量残留营养细胞的混合物。

 

洗涤：用 预冷的无菌蒸馏水或缓冲液重悬沉淀并离心洗涤 数次（通常2-3次），去除培养基残留物和代谢产物。

 

热处理（纯化芽孢）：这是获得高纯度芽孢的关键步骤。将洗涤后的沉淀重悬于适量无菌水或缓冲液中。

 

置于 80°C 水浴中加热 10-15分钟。

 

原理：此温度下，残留的营养细胞会被杀死，而成熟的芽孢能存活下来。

 

注意：加热时间和温度需根据菌种芽孢耐热性优化。某些菌株可能需要更高温度或更长时间。

 

再次离心和洗涤：将热处理后的悬液离心，弃上清（上清中含有被杀死的营养细胞碎片），用无菌水或缓冲液洗涤沉淀1-2次。

 

重悬与保存：将纯净的芽孢沉淀重悬于适量的 保护剂溶液（如10-20% 甘油溶液、脱脂牛奶）或无菌水中。分装后，可短期保存于 4°C，长期保存于 -20°C 或 -80°C。冷冻干燥是长期保存芽孢的极佳方法。

 

5、芽孢计数与活力测定（验证）：

 

显微镜计数（血球计数板）：结合芽孢染色（如孔雀绿-沙黄染色），区分芽孢和杂质颗粒，进行总芽孢计数。

 

平板计数（活菌计数）：

 

将芽孢悬液用无菌水或缓冲液进行 系列梯度稀释（如10倍系列稀释）。

 

涂布或倾注到 合适的营养琼脂平板上。

 

在适宜温度下培养 24-48小时。

 

计数形成的菌落数（CFU）。

 

原理：每个活的芽孢在营养丰富的条件下会萌发并生长成一个菌落。CFU/mL 即代表每毫升悬液中可萌发的活芽孢数。

 

芽孢得率计算：(收获的活芽孢总数 / 接种的营养细胞总数) * 100%。优化培养条件旨在提高得率。

 

四、关键注意事项

 

菌株特异性：不同菌株甚至同一菌株的不同亚株对芽孢培养基和培养条件的敏感性可能不同。初次使用时建议查阅文献或进行预实验优化（培养基选择、接种量、培养时间、温度）。

 

无菌操作：全程严格无菌操作，避免污染。

 

培养基灭菌：芽孢培养基需彻底高压蒸汽灭菌（121°C, 15-20分钟）。

 

Mn²的重要性：对于需氧芽孢杆菌，Mn²是许多经典配方中的关键组分，浓度过低或缺失会显著降低芽孢形成率。

 

溶氧（对需氧菌）：剧烈振荡或通气对于需氧芽孢杆菌的芽孢形成至关重要。

 

厌氧环境（对梭菌）：必须使用预还原的培养基并在严格厌氧条件下培养。

 

培养时间：时间过短，芽孢未充分形成或成熟；时间过长，已形成的芽孢可能开始萌发或自溶。定期镜检监控是必要的。

 

热处理优化：热处理是纯化芽孢的有效方法，但温度和时间必须严格控制，既要杀死营养细胞，又不能损伤目标芽孢的活力。

 

储存：纯化后的芽孢在4°C水中会缓慢丧失活力。添加保护剂（如甘油）并低温（-20°C以下）或冻干保存能大大提高稳定性。

 

五、总结

 

菌种芽孢培养基的核心原理是通过营养限制（饥饿） 作为主要信号，辅以关键离子（如Mn²）、高细胞密度、适宜的温度和氧气条件，诱导细菌启动复杂的芽孢形成程序。其使用方法强调预培养获得高密度营养细胞、接种到特定配方的芽孢培养基中、长时间振荡（或厌氧）培养诱导、以及后续的芽孢收获、热处理纯化、计数和保存。成功获得高产量和高纯度的芽孢需要根据目标菌株仔细选择和优化培养基配方及培养条件。

 

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