纯菌株生长率的常用测定方法及核心步骤与注意事项！

 

百欧博伟生物：测定纯菌株的生长率是微生物学中的基础实验，核心在于精确追踪特定培养条件下活菌数量或生物量随时间的变化，尤其是在对数生长期的指数增长速率。以下是常用的测定方法和关键步骤：

 

一、常用测定方法

 

1、平板菌落计数法（最准确，测活菌数）

 

原理：将菌液梯度稀释，涂布平板培养后计数单菌落（CFU）。

 

步骤：

 

定期取样（如0, 2, 4, 6, 8, 24小时）。

 

用无菌生理盐水或缓冲液进行十倍系列稀释。

 

取适宜稀释度的菌液涂布或倾注平板（通常做3个平行）。

 

适宜温度下培养24-48小时，计数30-300 CFU的平板。

 

计算每毫升原菌液中的活菌数（CFU/mL）。

 

优点：直接测定活菌数，结果准确可靠。

 

缺点：操作繁琐、耗时长、无法实时监测。

 

2、分光光度法（测浊度，间接反映生物量）

 

原理：利用菌体悬浮液对光的散射（OD值），常用波长600 nm（OD）。

 

步骤：

 

在无菌锥形瓶（如含100mL培养基）中接种少量纯菌株（确保初始OD低）。

 

置于摇床（恒温、适宜转速）培养。

 

定期取样，用未接种的培养基作空白对照，测定OD值。

 

记录OD值随时间的变化。

 

优点：快速、简便、非破坏性、可实时/半实时监测。

 

缺点：

 

测定的是总生物量（包括死菌），不区分活菌。

 

需建立OD与CFU/mL的标准曲线（通过平板计数校准）。

 

仅适用于均匀悬浮生长的菌株（不适用于成团、成膜菌）。

 

线性范围有限（通常OD < 0.5），超过后需稀释再测。

 

3、干重法（直接测生物量总量）

 

原理：收集菌体，洗净干燥后称重。

 

步骤：

 

取一定体积培养液，离心收集菌体。

 

用无菌水或缓冲液洗涤数次（去除培养基残留）。

 

将菌体转移至已称重的滤膜或离心管，在105°C烘干至恒重。

 

冷却后称重，计算单位体积培养液的菌体干重（mg/mL或 g/L）。

 

优点：直接测量生物量总量，结果直观。

 

缺点：破坏性取样、操作繁琐、耗时、灵敏度较低（需大量菌体）。

 

4、流式细胞术（FCM）

 

原理：用荧光染料区分活/死菌，快速计数单细胞。

 

优点：高通量、可区分生理状态、快速。

 

缺点：仪器昂贵、需优化染色条件。

 

二、核心步骤与注意事项

 

1、菌株与培养基：

 

确保使用纯培养物（单菌落来源）。

 

选择最适培养基和培养条件（温度、pH、溶氧等）。

 

2、接种：

 

使用对数生长期的新鲜菌液接种。

 

接种量宜小（如1%），确保初始菌密度低（OD ≈ 0.05），能清晰观察到完整的生长曲线。

 

3、取样与时间点：

 

对数生长期需密集取样（如每30-60分钟），延滞期和稳定期间隔可延长。

 

严格保持无菌操作。

 

每次取样后立即测定或适当保存（如4°C冷藏，尽快处理）。

 

4、平行与重复：

 

必须设置生物学重复（≥3个平行培养物）。

 

每次测定设置技术重复（如测OD时读3次取平均；平板计数做3个平行平板）。

 

5、数据记录：

 

精确记录取样时间、培养条件、稀释倍数、测量值等。

 

三、计算生长率

 

1、绘制生长曲线：

 

以时间（小时）为横坐标，以对数坐标下的CFU/mL（或OD、干重）为纵坐标作图。

 

识别出对数生长期（直线段）。

 

2、计算比生长速率（μ）：

 

在对数生长期，菌体数量呈指数增长：N_t = N_0 * e^(μt)

 

比生长速率公式：μ = (ln N_t - ln N_0) / (t - t_0)（单位：h¹）

 

N_t：时间t时的菌量（CFU/mL 或 OD）

 

N_0：时间t时的菌量

 

t - t_0：时间间隔（小时）

 

3、计算代时（Generation Time, Doubling Time）：

 

代时（g）是菌量翻倍所需的时间：g = ln2 / μ ≈ 0.693 / μ（单位：小时）

 

四、关键注意事项

 

校准：使用OD法时，必须用平板计数法建立该菌株在特定条件下的OD - CFU/mL标准曲线。

 

范围：OD法仅在低OD值范围内（通常<0.5）与细胞浓度呈线性关系，超出范围需稀释。

 

对照：分光光度法必须用未接种的培养基调零（空白对照）。

 

稳定性：严格控制培养条件（温度、摇床转速），避免波动影响结果。

 

生理状态：接种菌株的生理状态和培养历史需保持一致。

 

曲线完整性：确保取样覆盖所有生长时期，尤其是对数期早期。

 

五、总结

 

推荐组合：分光光度法（实时监测OD）+ 平板计数法（关键时间点校准）是最常用且可靠的方法。

 

核心输出：比生长速率（μ）和代时（g）是衡量纯菌株生长能力的核心参数。

 

严谨性：严格的实验设计、无菌操作、充分的平行重复和准确的数据记录是获得可靠结果的基础。

 

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