细胞实验如何选择培养基和进行换液操作的详细指南！

 

百欧博伟生物：在细胞实验中，“选细胞液”通常指的是选择适合你培养细胞的培养基（Cell Culture Medium），而“换液”（Media Change）则是更换培养容器中旧培养基为新培养基的过程。这两者紧密相关，选择正确的培养基是换液操作的基础和前提。以下是如何选择培养基和进行换液操作的详细指南：

 

一、如何选择培养基（“细胞液”）

 

选择培养基是细胞培养成功的关键第一步。没有“万能”的培养基，选择取决于：

 

细胞类型：

 

细胞来源物种：人源、小鼠、大鼠等。

 

细胞种类：是原代细胞（直接从组织分离）还是已建立的细胞系？是贴壁细胞还是悬浮细胞？是正常细胞还是癌细胞？是干细胞还是分化细胞？

 

查找文献/数据库：

 

查阅文献：查找研究同类型细胞的已发表论文，看他们使用什么培养基。

 

ATCC/DSMZ/ECACC等细胞库：这些权威机构会为它们保存的每一株细胞提供详细的培养条件说明，包括推荐的培养基、血清类型和浓度、添加剂等。这是最可靠的信息来源！

 

基础培养基种类：

 

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)：应用最广泛的基础培养基之一，适用于多种贴壁细胞。有高糖（4500mg/L）和低糖（1000mg/L）版本，高糖更常用。

 

MEM (Minimum Essential Medium)：历史悠久的培养基，成分相对简单，适用于多种细胞。

 

RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640)：最初为淋巴细胞设计，现在广泛用于悬浮细胞和某些贴壁细胞。

 

IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)：在DMEM基础上改良，血清需求较低，常用于造血细胞、杂交瘤细胞等。

 

Ham's F12 / DMEM-F12：Ham's F12营养丰富，常与DMEM混合成DMEM/F12 (1:1)，适用于原代细胞、干细胞（如神经干细胞）、转染效率要求高的实验等。

 

McCoy's 5A：适用于多种原代细胞和癌细胞系（如卵巢癌细胞）。

 

Stem Cell专用培养基：专为维持胚胎干细胞或诱导多能干细胞未分化状态设计，成分明确，通常不含血清。

 

无血清培养基：成分明确，不含动物来源成分，用于需要精确控制培养条件、减少批次差异、下游应用或研究特定因子作用的实验。需要添加特定的生长因子、激素、载体蛋白等。

 

血清：

 

类型：胎牛血清是最常用的（FBS/FCS），提供丰富的生长因子、激素、粘附因子、营养物质。有时也使用新生牛血清、马血清等。

 

浓度：通常添加5%-20%，最常见是10%。浓度过高可能促进分化或抑制某些细胞生长；过低则可能无法支持细胞良好生长。必须参考细胞库或文献的具体推荐。

 

批次：血清是天然产物，批次间差异显著。强烈建议：

 

预先测试：对新批次血清进行细胞生长曲线、克隆形成率等测试。

 

大量购买同一批次：一旦选定合适批次，尽量购买足够长时间使用的量。

 

热灭活：56°C水浴30分钟，灭活补体。并非所有细胞都需要！仅在特定实验（如免疫学研究、某些病毒培养、或已知该批次血清对细胞有毒性时）进行。热灭活会损失部分生长因子。

 

添加剂：

 

抗生素：常用青霉素-链霉素双抗（Pen-Strep），浓度通常为50-100 U/mL青霉素 + 50-100 µg/mL链霉素。用于防止细菌污染。注意： 长期使用抗生素可能掩盖低水平污染或诱导细胞抗性。无菌操作熟练后，可在某些实验（如原代培养、转染前）考虑不加。

 

抗真菌剂：如两性霉素B、制霉菌素等，仅在怀疑或处理真菌污染时短期使用，对细胞可能有毒性。

 

L-谷氨酰胺：细胞重要碳源和氮源，不稳定（在4°C和37°C下会降解）。基础培养基中通常已含，但需注意有效期。使用时额外添加（终浓度2-4mM）或使用稳定的GlutaMAX添加剂。

 

HEPES缓冲液：在CO2培养箱环境外提供更好的pH缓冲能力（如显微镜观察、操作时间较长时），常用浓度10-25mM。

 

丙酮酸钠：能量来源，对某些细胞有益。

 

非必需氨基酸：补充营养。

 

β-巯基乙醇：抗氧化剂，常用于杂交瘤和干细胞培养。

 

特定生长因子/细胞因子：在无血清或低血清培养中尤其重要。

 

实验目的：

 

维持培养：选择能支持细胞稳定增殖的标准培养基。

 

诱导分化：需要换成特定的分化培养基（成分不同，常不含或含低浓度血清，添加特定诱导因子）。

 

转染：某些培养基血清和蛋白含量低，可提高转染效率。转染后需要换回完全培养基。

 

药物处理/刺激实验：可能需要使用无血清或低血清培养基一段时间（血清饥饿同步化），以减少血清中未知因子的干扰。处理时也常在无/低血清培养基中进行。

 

收集上清/条件培养基：可能需要使用无血清培养基。

 

冻存细胞：需要使用专门的冻存培养基（通常含高浓度血清和DMSO）。

 

总结选择步骤：

 

明确你的细胞类型。

 

查询ATCC/DSMZ/ECACC等数据库或相关文献推荐的培养基、血清浓度及关键添加剂。

 

根据实验目的（维持、分化、处理等）判断是否需要调整基础培养基或添加剂（如换无血清、去除抗生素等）。

 

购买高质量、信誉好的品牌培养基和血清。

 

对新批次血清进行必要的细胞生长测试（强烈推荐）。

 

严格记录使用的培养基品牌、货号、批号、血清批号、所有添加剂浓度及配制日期。这对实验可重复性至关重要！

 

二、如何进行细胞换液

 

换液是为了：

 

去除细胞代谢废物（乳酸、氨等）。

 

补充消耗殆尽的营养物质（葡萄糖、氨基酸、生长因子等）。

 

维持稳定的pH值（培养基中的缓冲系统会被代谢物影响）。

 

去除死细胞碎片。

 

在特定实验中引入或去除某些因子。

 

换液频率：

 

取决于细胞生长速度、接种密度、培养基体积。通常贴壁细胞每2-3天换液一次，快速生长的细胞可能需要每天换液。

 

观察是关键！培养基颜色是重要指标：

 

鲜红/橙红色（酚红指示剂）：pH正常（~7.4）。

 

黄色：变酸（pH下降），通常由于代谢废物积累（乳酸），说明急需换液。

 

紫红色：变碱（pH升高），较少见，可能由污染或过度通气引起。

 

细胞密度过高时也需要更频繁换液。

 

标准换液操作步骤（以贴壁细胞为例）：

 

准备：

 

将新鲜完全培养基放入37°C水浴锅中预热（至少15-30分钟，冷培养基会“热休克”细胞）。避免长时间水浴增加污染风险。

 

预热PBS（用于清洗，如果实验需要或细胞敏感）。

 

准备好无菌移液管、废液缸、75%酒精喷壶、记号笔。

 

在超净工作台内进行所有操作，台面用酒精擦拭消毒。

 

戴上手套，并用酒精消毒手套。

 

取出细胞：

 

从CO2培养箱中小心取出培养瓶/皿/板，避免剧烈晃动。

 

在显微镜下快速观察细胞状态（形态、密度、污染迹象）。

 

移除旧培养基：

 

轻柔操作！避免吸头触碰到细胞层，尤其是贴壁不牢的细胞。

 

打开培养器皿盖子（在酒精灯火焰旁操作以减少污染风险）。

 

用无菌移液管（或真空泵连接无菌吸管）小心地从培养器皿的一角（贴壁细胞）或边缘（悬浮细胞离心后）吸出旧培养基，弃入废液缸。

 

关键：不要直接倾倒！容易导致细胞脱落或污染。

 

（可选）清洗细胞：

 

对于代谢废物多、需要精确去除血清/药物、或细胞敏感的情况：

 

向培养器皿中加入少量预热的无菌PBS（足以覆盖细胞层即可）。

 

轻轻摇晃，洗涤细胞表面。

 

完全吸弃 PBS。可重复一次。

 

注意：频繁清洗或PBS残留可能对某些细胞有损伤，非必需步骤可省略。

 

加入新培养基：

 

取预热的新鲜完全培养基，沿培养器皿壁缓慢加入，避免直接冲击细胞层。

 

加入适量体积（通常与原体积相同，或根据实验需求调整）。培养瓶要保证能形成足够的气液接触面。

 

放回培养箱：

 

盖紧盖子（培养瓶需拧松约1/4圈以保证气体交换）。

 

做好标记（换液日期、操作者）。

 

平稳放回37°C, 5% CO2，饱和湿度的培养箱中。

 

针对悬浮细胞的换液：

 

将细胞悬液连同旧培养基一起转移到无菌离心管中。

 

在室温或4°C下进行低速离心（根据细胞类型调整，通常200-400g，5分钟）。目的是沉淀细胞，避免过度离心损伤细胞。

 

小心吸弃上清（旧培养基），避免吸到细胞沉淀。

 

用少量预热的新鲜完全培养基或PBS（如果需要清洗）轻柔重悬细胞沉淀。

 

再次离心（如果需要清洗）。

 

吸弃上清（或清洗液）。

 

用适量预热的新鲜完全培养基轻柔重悬细胞。

 

将细胞悬液转移回原培养器皿或新的培养器皿中（如果传代或扩增）。

 

放回培养箱。

 

关键注意事项：

 

无菌！无菌！无菌！这是细胞培养的生命线。所有操作在超净台进行，物品表面和手部用酒精消毒，正确使用火焰，避免在开放区域长时间暴露。

 

轻柔操作：避免剧烈摇晃、吹打、移液冲击细胞，尤其是贴壁细胞和原代细胞。

 

温度：培养基和PBS必须预热到37°C。冷热应激会严重损伤细胞。

 

避免过度换液/清洗：不必要的操作增加污染风险和细胞应激。

 

观察记录：每次换液前后观察细胞形态和密度，记录任何异常（颗粒、浑浊、pH异常、细胞形态改变）。

 

血清批次一致性：不同批次血清差异大，尽量使用同一批次，更换批次前务必测试。

 

培养基有效期：注意基础培养基、谷氨酰胺、添加物等的有效期。配制好的完全培养基通常在2-4周内使用（4°C避光保存），谷氨酰胺最好现加现用或使用GlutaMAX。

 

常见错误：

 

使用未预热的培养基/PBS。

 

移液时吸头碰到细胞层导致细胞脱落。

 

直接倾倒旧培养基导致细胞损失或污染。

 

换液频率不当（太频繁浪费且应激，太少细胞状态差）。

 

忽略细胞库/文献推荐的培养基配方。

 

未测试新批次血清。

 

无菌操作不规范。

 

结论：

 

选择合适的培养基是细胞实验的基石，需要根据细胞类型和实验目的仔细查询和验证。换液是常规但至关重要的操作，必须严格遵守无菌和轻柔的原则，并注意温度控制和观察记录。熟练掌握这两项技能是获得可靠、可重复的细胞实验结果的基本保障。

 

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