实验室空白对照平板长菌的原因分析方向与排查步骤！

 

百欧博伟生物：空白对照平板长出菌落，这是一个非常严重的问题，它直接质疑了你整个实验的无菌操作和结果的可靠性。必须进行彻底的原因分析。以下是一个系统性的分析思路和排查步骤：

 

一、核心原则

 

空白对照的目的是监测整个实验流程中是否存在污染。如果空白长菌，说明在从灭菌到培养结束的某个或多个环节引入了污染物（通常是细菌或真菌孢子）。

 

二、原因分析方向与排查步骤

 

1、培养基灭菌不彻底 (最常见原因之一)

 

排查：

 

灭菌锅验证：最近一次灭菌锅的生物指示剂测试（如嗜热脂肪芽孢杆菌条）是否合格？物理监测（温度、压力、时间）记录是否完整且符合要求？

 

装载方式：灭菌时培养基是否装载过密？是否阻碍了蒸汽穿透？灭菌锅排水口是否通畅？

 

灭菌参数：灭菌温度、压力、时间是否设置正确并准确执行？是否达到121°C至少15分钟？

 

冷却过程：灭菌后培养基是否在超净台内冷却？在冷却过程中，容器是否密封？如果在水浴中冷却，水浴锅是否干净？水面是否低于容器口？

 

2、平板倾注/操作过程中的污染 (最常见原因之一)

 

排查：

 

超净台/生物安全柜：

 

使用前是否开启足够时间（通常15-30分钟）进行自净？风速是否正常（定期检测）？

 

高效过滤器是否过期？是否定期检测和更换？

 

台面是否彻底清洁消毒（使用前后）？是否有液体残留？

 

操作时台内物品是否摆放过多、过乱，阻碍了气流？是否频繁、大幅度地进出操作区？

 

操作时是否在正确的"洁净区域"（通常离前窗10-15cm以内）进行？

 

操作者：

 

无菌操作规范是否严格遵守？是否戴手套、口罩？是否用酒精消毒手套？

 

动作是否过大、过快，引起气流紊乱？

 

是否在操作过程中说话、咳嗽、打喷嚏？(这是常见污染源)

 

手臂是否频繁越过敞开的平板/培养基上方？

 

无菌器具：

 

用于倾注的培养瓶口、移液管、吸头等是否在火焰上充分灼烧灭菌？

 

移液器是否可能被污染？(尤其是吸液操作时)

 

平板盖子打开的角度是否过大？暴露时间是否过长？

 

倒平板时，培养瓶口是否触碰了平板边缘或外部环境？

 

3、无菌水/稀释液污染

 

排查：

 

用于制备空白对照的无菌水/缓冲液是否确实无菌？其灭菌记录和保存条件如何？

 

分装容器是否无菌？是否在超净台内分装？

 

开启后是否在规定时间内使用？是否被污染？

 

4、平板本身或包装问题

 

排查：

 

购买的一次性无菌平板，包装是否完好无损？有无破损、受潮？

 

是否在有效期内？

 

如果是自制的平板，培养皿灭菌是否彻底？

 

5、培养箱污染

 

排查：

 

培养箱内部是否定期清洁消毒？是否有冷凝水积聚？（冷凝水是很好的污染源）

 

培养箱内的搁架、隔板是否干净？是否有多余的培养基残留？

 

培养箱的密封性是否良好？空气过滤装置（如有）是否有效？

 

是否同时培养了大量高浓度微生物样品？存在气溶胶污染风险？

 

6、环境因素

 

排查：

 

实验室整体环境是否清洁？是否有大量扬尘？

 

超净台放置的位置是否合理？是否处于人员频繁走动、门开关频繁或气流紊乱的区域？

 

实验室的HVAC系统（通风空调系统）是否正常运行？压差是否符合要求（特别是无菌操作区域应为正压）？

 

7、其他容易被忽视的因素

 

灭菌锅排水不畅：导致灭菌锅底部积水，温度达不到要求。

 

灭菌锅冷空气未排尽：导致局部温度不够。

 

培养基成分：某些特殊成分在高温灭菌后分解产生颗粒，被误认为是菌落（需显微镜确认）。

 

冷凝水污染：倒好的平板在冷却过程中，盖子内壁产生冷凝水，如果操作不当，冷凝水滴落至培养基表面可能带入污染物。

 

操作台表面消毒剂失效：使用的酒精浓度不足（应70-75%）或已挥发失效。

 

三、如何确定具体原因？

 

1、回顾记录：仔细检查实验记录，包括灭菌参数、操作过程描述、环境温湿度等。

 

2、重现实验 (非常重要)：

 

单独灭菌培养基：单独灭菌一批培养基，不做任何操作，直接倒空白平板培养。如果长菌，问题在灭菌或平板本身。

 

空白操作测试：在超净台内，使用无菌水（确认无菌）进行模拟样品处理的所有操作步骤（如稀释、移液、倾注），培养空白对照。如果长菌，问题在操作过程或超净台。

 

环境监测：在操作期间，在超净台内不同位置放置打开的TSA平板暴露一定时间（如30分钟），然后盖上培养，看是否长菌以及菌落分布，评估超净台洁净度。

 

培养箱监测：在培养箱不同位置放置打开的TSA平板暴露一定时间（如15-30分钟），盖上培养，检查是否长菌。

 

3、菌落形态观察：观察空白对照上的菌落形态、颜色、大小是否一致？如果形态多样，说明污染源复杂；如果形态单一，可能指向特定污染源（如操作者口腔菌、环境中的特定菌）。这有助于缩小范围。

 

4、系统检查设备：

 

超净台：检测风速、高效过滤器完整性（PAO/DOP测试）。

 

灭菌锅：进行物理验证（温度探头）和生物指示剂验证。

 

培养箱：清洁消毒，检查温湿度均匀性。

 

5、检查耗材和试剂：确认无菌水、缓冲液、一次性平板的无菌性（可抽样培养测试）。

 

四、总结与建议

 

立即暂停相关实验！直到问题解决。

 

系统性排查：按照上述方向逐一排查，不要遗漏任何环节。

 

重视重现测试：这是锁定问题来源最有效的方法。

 

加强记录：所有操作、设备参数、维护、验证都必须有详细记录，便于追溯。

 

强化培训：确保所有操作人员都经过严格的无菌操作培训并理解其重要性。

 

定期维护与验证：对关键设备（超净台、灭菌锅、培养箱）进行定期维护、清洁和性能验证。

 

建立SOP并严格遵守：详细的无菌操作标准操作规程（SOP）是保证无菌的基础。

 

找出空白污染的原因需要耐心和细致。通过科学的方法逐步排查，一定能找到污染源并加以解决，确保后续实验结果的准确性和可靠性。

 

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