生物制品安全性中支原体污染检测的核心要求与方法详解！

 

百欧博伟生物：生物制品（包括疫苗、单克隆抗体、细胞治疗产品、基因治疗产品等）的安全性至关重要，其中支原体污染是生产过程中需要严格监控的关键风险之一。支原体污染可能源自细胞库、原材料、操作人员或环境，其危害巨大且检测具有一定挑战性。以下是对生物制品支原体污染检测的详解：

 

一、为什么支原体污染如此危险？

 

1、难以察觉：

 

体积微小：支原体是最小的可自我复制的原核生物（0.2-0.3 µm），光学显微镜下难以直接观察。

 

无细胞壁：对作用于细胞壁的抗生素（如青霉素）天然耐药，常规抗生素预防无效。

 

低水平污染：初期污染可能不引起明显的细胞病变效应或培养液浑浊，容易被忽视。

 

2、危害严重：

 

影响细胞功能：支原体寄生在细胞表面或内部，竞争性消耗营养物质，改变细胞代谢，诱导或抑制基因表达，导致细胞生长缓慢、形态改变、染色体异常、代谢产物改变、细胞凋亡等。

 

干扰实验结果：在研发阶段，污染会导致实验数据不可靠、结果无法重复。

 

改变产品特性：在生物制品生产中，污染会改变目标蛋白的表达、糖基化模式，或影响病毒载体的产量和感染性。

 

潜在安全隐患：终产品中残留的支原体或其成分可能引发患者严重的免疫反应、发热、器官损伤甚至脓毒症等不良反应。细胞治疗产品中的活支原体可能直接感染患者。

 

3、传播性强：通过气溶胶、操作人员、污染的试剂或培养基、共用设备等途径极易在实验室或生产车间内扩散。

 

二、支原体污染检测的核心要求

 

高灵敏度：必须能检测到极低水平的污染（法规通常要求能检测到 ≤ 10 CFU/mL 的污染）。

 

高特异性：准确识别支原体，避免与其他微生物或细胞成分混淆导致假阳性或假阴性。

 

广谱性：能检测多种可能污染细胞培养的支原体物种（常见的有几十种）。

 

可靠性：结果稳定、可重复。

 

法规符合性：必须符合各国药典（如中国药典ChP、美国药典USP、欧洲药典EP、日本药典JP）和国际指南的要求。

 

三、主要的支原体检测方法详解

 

检测方法主要分为两大类：基于培养的方法和非培养的分子生物学方法。通常需要结合使用以满足法规的全面性要求。

 

(一) 基于培养的方法 - “金标准”

 

1、液体培养基培养 & 琼脂平板培养法：

 

原理：将待测样品接种到富含营养的液体培养基中，支原体生长代谢会改变培养基的pH（酚红指示剂变色）。阳性培养物需进一步转种到琼脂平板上，在微需氧或厌氧环境下培养，观察特征性“煎蛋”样菌落。

 

样品：待检生物制品或其代表物（如收获液、未加防腐剂的半成品或成品）、细胞培养上清液、细胞裂解液、主/工作细胞库。

 

培养基：使用经验证、支持多种支原体生长的复合培养基，通常包含血清、酵母提取物、精氨酸/葡萄糖等。

 

指示细胞：通常需要同时接种Vero细胞或其他易感细胞系（作为指示细胞）进行共培养，以放大可能存在的低水平污染。

 

培养时间：至少14天（EP要求培养至第28天观察），需频繁观察。

 

阳性对照：需同时接种低浓度（≤ 100 CFU/mL）的标准支原体株。

 

阴性对照：培养基对照。

 

优点：是药典规定的法定方法，能检测活的、可培养的支原体，灵敏度高（理论上可检测1个CFU），特异性强（看到菌落），广谱性好。

 

缺点：耗时长（14-28天），操作繁琐（需多次传代、染色、镜检），需要熟练技术人员判断结果，部分支原体在无细胞培养基中生长缓慢或困难，需依赖指示细胞法补充。

 

2、指示细胞培养法结合DNA荧光染色法：

 

原理：将待测样品接种到贴壁生长的指示细胞上，共培养3-5天，使支原体在细胞表面增殖。固定细胞后，用特异性结合DNA的荧光染料染色，在荧光显微镜下观察。支原体DNA会在真核细胞核周围呈现点状或丝状荧光。

 

样品：同液体/琼脂培养法。

 

培养时间：通常3-5天。

 

优点：比液体/琼脂培养法快，能检测依赖细胞生长的支原体，灵敏度高（可检测低至100-1000 CFU/mL），显微镜下可直观看到支原体与细胞的关联。

 

缺点：需要荧光显微镜和有经验的技术人员判读，存在主观性，染色背景可能干扰（如细胞碎片、死细胞、其他微生物），对非细胞依赖性支原体的灵敏度可能不如液体培养法。通常作为液体/琼脂培养法的补充或替代（需验证）。

 

(二) 非培养的分子生物学方法 - 快速、主流

 

1、核酸扩增技术：是目前应用最广泛、速度最快的检测方法，特别是用于过程控制和放行检测。

 

通用PCR：

 

原理：利用针对支原体高度保守的16S rRNA基因或16S-23S rRNA基因间隔区设计的通用引物，对待测样品DNA进行PCR扩增。扩增产物通过凝胶电泳观察条带，或进行测序确认。

 

优点：快速（数小时），灵敏度高（理论上可检测几个基因组拷贝），特异性较好。

 

缺点：无法区分死活菌，存在假阳性（污染、引物二聚体）和假阴性（抑制剂）风险，凝胶电泳灵敏度有限，广谱性依赖于引物设计（需覆盖常见污染菌种）。

 

实时荧光定量PCR：

 

原理：在PCR反应体系中加入荧光标记的探针，实时监测扩增过程中荧光信号的积累，实现定量或定性检测。是目前最主流的快速检测方法。

 

优点：极其快速（通常2-4小时），灵敏度极高（可检测低至个位数基因组拷贝），特异性极强（探针增加了特异性），可定量（评估污染水平），闭管操作减少污染风险，自动化程度高。

 

缺点：设备成本高，无法区分死活菌，对样品中PCR抑制物敏感，引物/探针设计需要非常严谨以确保广谱性。

 

多重PCR/qPCR：可同时检测多种特定支原体物种或包含内标以监控PCR抑制。

 

等温扩增技术：如环介导等温扩增，操作更简单，无需热循环仪，但应用不如qPCR广泛。

 

2、新一代测序：

 

原理：对样品总DNA进行高通量测序，通过生物信息学分析比对微生物数据库，理论上可无偏倚地检测所有已知甚至未知的微生物（包括支原体）。

 

优点：无需预设目标，可提供物种信息，灵敏度高。

 

缺点：成本高，数据分析复杂，耗时相对较长（数天），对背景微生物DNA敏感，难以精确定量，法规认可度仍在发展中，目前更多用于调查性检测或特殊研究。

 

(三) 酶学法

 

原理：检测支原体特有的酶活性。试剂与样品混合后，通过生物发光信号的变化判断是否存在支原体。

 

优点：快速（约20分钟），操作简单，可半定量。

 

缺点：广谱性存疑（并非所有支原体都表达高水平的该酶），灵敏度可能不如qPCR和培养法，存在假阳性/假阴性风险（受细胞状态、样品成分影响），通常不被药典认可作为放行检测的唯一方法，多用于过程监控或初步筛查。

 

四、法规要求与检测策略

 

药典规定：主要药典（ChP, USP, EP, JP）均明确规定生物制品（特别是来源于细胞培养的产品）在其生产和放行过程中必须进行支原体检测。

 

检测对象：主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、病毒收获液、未加防腐剂的半成品/成品等关键阶段样品。

 

方法选择与组合：

 

放行检测：通常要求使用两种不同原理的方法，其中一种必须是基于培养的方法（液体/琼脂培养法或指示细胞法）。qPCR因其快速、灵敏、特异，已成为另一种常用方法（需经过充分验证）。

 

过程控制/中间品检测：主要采用快速方法，用于及时监控生产过程中的污染风险，指导生产决策。

 

验证：任何用于放行检测的方法（尤其是NAT方法）都必须按照GMP/GLP要求进行严格的方法学验证，包括：

 

特异性：检测目标支原体而不与非目标微生物/细胞DNA交叉反应。

 

灵敏度/检测限：确定能可靠检出的最低污染水平（通常≤10 CFU/mL或等效基因组拷贝数）。

 

耐用性：方法对微小变异的承受能力（如试剂批次、操作人员、仪器）。

 

准确性：与药典方法（培养法）的等效性研究。

 

精密度：重复性和中间精密度。

 

抑制试验：证明在样品基质存在下仍能有效检测低水平污染（通常加入内标监控）。

 

样品处理：对于可能含有支原体抑制物的样品（如含血清、抗生素、细胞碎片的产品），需要进行适当处理，如浓缩、稀释、过滤、DNA提取纯化等，以提高检测灵敏度并去除抑制剂。处理过程本身不能引入污染或损失目标支原体。

 

五、关键挑战与注意事项

 

死活菌区分：NAT方法无法区分死活菌，阳性结果可能来自死菌残留的DNA。培养法是检测活菌的“金标准”。在调查污染来源和评估风险时需考虑此点。

 

广谱性验证：确保所选方法（特别是引物/探针）能有效覆盖所有常见的、可能造成污染的支原体物种。

 

PCR抑制：样品中的复杂成分（如血红蛋白、肝素、某些培养基成分、高浓度DNA）可能抑制PCR反应，导致假阴性。必须使用内标监控每个样品的扩增效率。

 

污染控制：支原体检测实验室本身必须严格防止交叉污染（尤其是NAT实验室），需分区操作，使用带滤芯的吸头，严格遵循操作规范。

 

人员培训与经验：判读结果（尤其是培养法和指示细胞法）需要经验丰富的技术人员。

 

趋势分析与调查：建立检测数据库，进行趋势分析。一旦发现阳性或可疑结果，必须启动彻底的偏差调查，追溯污染源，评估对产品的影响，并采取纠正预防措施。

 

总结

 

支原体污染是生物制品安全的重大威胁。其检测需要综合运用基于培养的“金标准”方法（满足法规广谱性和活菌检测要求）和快速、高灵敏的分子生物学方法。严格遵守药典规定，进行严谨的方法验证和样品处理，实施严格的实验室污染控制，并结合专业的人员判读和科学的趋势分析/偏差调查，是确保生物制品免受支原体污染、保障患者安全的基石。随着技术发展，qPCR等分子方法的应用日益广泛和成熟，但基于培养的方法因其检测活菌的不可替代性，在法规放行检测中仍占据核心地位。

 

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