微生物菌种资源复核规程的目的与范围及复核内容与方法！

 

百欧博伟生物：微生物菌种资源复核规程是确保保藏菌种活性、纯度、稳定性和准确性的关键质量控制程序。这是一份通用的规程框架，具体细节需要根据菌种保藏机构的性质、保藏微生物的种类（细菌、真菌、放线菌、病毒等）、保藏方法以及遵循的质量标准进行调整。

 

一、目的：

 

确保保藏菌种的活性（存活能力）符合预期要求。

 

确认菌种的纯度和无污染状态。

 

验证菌种的形态学、生理生化或分子生物学特征的稳定性。

 

核实菌种的分类学信息（种属鉴定）和菌株标识的准确性。

 

及时发现保藏过程中的问题（如交叉污染、退化、标签错误）。

 

为菌种分发提供质量保证依据。

 

满足相关质量体系和法规的要求。

 

二、范围：

 

本规程适用于本机构保藏的所有微生物菌种资源。

 

涵盖新入库菌种、定期库存菌种、分发前菌种、复活后菌种以及冻干后菌种等。

 

适用于不同保藏形式（如斜面、穿刺、甘油管、冻干管、液氮等）。

 

三、职责：

 

菌种保藏管理员：负责制定复核计划、执行复核操作、记录结果、报告异常、维护复核记录。

 

质量负责人/主管：负责审核复核计划、批准规程、监督复核过程、处理偏差、确保符合质量要求。

 

技术支持人员：提供特定鉴定或检测技术支持（如分子生物学、特殊生理生化试验）。

 

安全负责人：确保复核过程中的生物安全措施到位。

 

四、定义：

 

复核：对保藏菌种进行的一系列测试，以确认其关键特性是否符合保藏要求。

 

活性：菌种在适宜条件下复苏生长的能力。

 

纯度：菌种培养物中仅含有目标微生物，无其他微生物污染。

 

稳定性：菌种在保藏期间关键特性（形态、生理、遗传）保持恒定的能力。

 

准确性：菌株标识（名称、编号、来源等）与保藏记录及实际特性一致。

 

参考菌株：用于对照试验的标准菌株。

 

标准操作程序：详细描述特定操作步骤的文件。

 

五、复核频率：

 

新入库菌种：入库前必须进行首次复核（包括活性、纯度、基本鉴定）。

 

定期复核：根据菌种稳定性、保藏方法、历史数据和风险评估确定周期（例如：每1年、2年、5年或更长）。高风险或关键菌种应缩短周期。

 

分发前复核：对拟分发的菌种进行活性与纯度复核（尤其是冻干菌种）。

 

复活后复核：从长期保藏状态（如液氮、冻干）复苏后，使用前需复核活性和纯度。

 

冻干后复核：完成冻干程序后，需立即抽取样品复核活性。

 

异常情况：当收到用户关于菌种问题的反馈、或发现存储条件异常时，应立即进行针对性复核。

 

长期不活动菌种：长期未分发或复核的菌种，在重新启用前需进行复核。

 

六、复核内容与方法：

 

复核内容应根据菌种类型和重要性进行选择，核心通常包括：

 

1、活性复核：

 

方法：将菌种从保藏状态（如刮取冻干菌粉、融化甘油管、取出液氮冻存管）接种到适宜的培养基上（固体平板、斜面或液体培养基），在适宜条件下培养。

 

判定：观察生长情况。应有典型生长（如菌落形成、液体变浑浊）。记录复苏时间、生长速度、生长量。定量方法可计算存活率（如对冻干品）。

 

标准：明确最低可接受的复苏标准（例如：冻干菌种复苏率 > 1%， 甘油管能在X天内长出典型菌落）。

 

2、纯度复核：

 

方法：

 

镜检：革兰氏染色、形态观察（有无杂菌形态）。

 

平板划线/涂布：观察菌落形态、颜色、大小是否均一。必要时挑取不同形态菌落进行鉴定。

 

液体培养：观察均匀浑浊度、有无沉淀、菌膜等异常。

 

选择性培养基：使用抑制目标菌种但允许潜在污染物生长的培养基进行反向验证（需谨慎设计）。

 

判定：无杂菌形态、无不均一菌落、无异常生长现象。

 

标准：无可见污染。

 

3、形态学复核：

 

方法：在标准培养基和培养条件下，观察记录菌落形态（大小、形状、边缘、隆起、表面、颜色、光泽、质地）、色素产生、溶血性等。显微镜观察细胞形态（形状、大小、排列、有无特殊结构如芽孢、鞭毛、荚膜等）。

 

判定：与原始记录或参考描述/图片进行比对。

 

标准：形态学特征稳定，无明显变异。

 

4、关键特性/稳定性复核：

 

方法：选择最能代表该菌种特性的1-3项关键生理生化指标进行测试（如特定碳源利用、酶活性、温度/PH/盐度耐受范围、抗生素敏感性、特定代谢产物产生）。分子生物学方法也可用于稳定性监测（尤其对基因工程菌）。

 

判定：与原始记录、参考菌株或标准描述进行比对。

 

标准：关键特性稳定，未发生显著退化或变异。

 

5、标识准确性复核：

 

方法：核对复核菌种的标签信息（菌株编号、名称、来源等）与保藏记录、数据库信息是否完全一致。必要时进行快速鉴定与记录信息比对。

 

判定：信息完全一致。

 

标准：零错误。

 

七、操作程序：

 

所有复核操作必须严格遵循相应的SOP（如无菌操作SOP、显微镜操作SOP、生理生化试验SOP、PCR操作SOP、生物安全SOP等）。

 

使用经过确认和校准的仪器设备。

 

使用合格的培养基、试剂和耗材。

 

在合适的环境条件下（洁净度、温湿度）进行操作。

 

做好个人防护（实验服、手套、必要时护目镜/口罩/生物安全柜）。

 

详细记录操作步骤、使用的材料、培养条件、观察时间等。

 

八、记录与报告：

 

复核记录表：设计标准化的记录表格，至少包含：

 

菌株唯一编号

 

复核日期

 

复核人

 

复核内容（活性、纯度、形态、特性、标识）

 

使用的方法和条件

 

观察/检测结果（文字描述、图片、数据）

 

判定结果（符合/不符合）

 

复核结论

 

备注（异常情况说明）

 

复核人签名，审核人签名（如需要）

 

结果报告：定期汇总复核结果，形成报告提交给质量负责人。报告应包含：

 

复核菌种清单及编号

 

复核类型（定期、分发前等）

 

复核项目及结果汇总

 

不符合项及处理措施

 

总体评估与建议（如是否需要增加复核频率、是否需要重新保藏、是否需停止分发等）

 

记录保存：所有原始记录、报告需妥善保存，保存期限应符合机构政策和法规要求（通常长期保存，至少10年或永久）。电子记录应有备份和安全措施。

 

九、结果判定与处理：

 

符合：所有复核项目均满足标准要求。菌株状态良好，可继续保藏和分发。

 

不符合：

 

活性低/无活性：尝试复活备份管（如有）。若仍失败，需评估原因，考虑重新分离或引进，并标记为“无活性”。

 

污染：立即隔离该菌株及可能受影响的批次。尝试纯化分离目标菌。若纯化失败或污染严重，需销毁并标记为“污染”。调查污染来源。

 

特性变异/退化：评估变异程度和重要性。尝试分离回复原始特性的单菌落。若无法回复或变异显著影响应用，需标记为“退化/变异”，并评估是否继续保藏/分发或重新引进。

 

标识错误：立即暂停该菌株分发。追溯错误来源，纠正所有记录和标签。评估影响范围。必要时进行准确鉴定。

 

偏差处理：任何不符合项或操作偏差均需按照《偏差处理程序》进行调查，记录根本原因，采取纠正预防措施。

 

十、生物安全：

 

复核操作必须在与其生物安全等级相匹配的实验室中进行。

 

操作潜在病原微生物时，必须严格遵守生物安全规范，使用生物安全柜，做好个人防护和消毒灭菌。

 

废弃物必须按照生物危险废弃物处理程序进行安全处置。

 

十一、参考文件：

 

相关SOP（无菌操作、培养基配制、生理生化试验、显微镜使用、分子生物学操作、生物安全、记录控制、偏差处理等）

 

菌种目录/数据库

 

微生物鉴定手册（《常见细菌系统鉴定手册》）

 

国际/国家菌种保藏中心操作规程

 

相关质量标准（ISO 9001, ISO/IEC 17025, OECD BRC指南等）

 

生物安全手册

 

十二、修订历史：

 

记录本规程的版本号、修订日期、修订内容、修订人、批准人。

 

重要提示：

 

风险评估：制定复核策略时应进行风险评估，考虑菌种价值、稳定性、保藏方法、使用频率、潜在风险（生物安全、误用）等因素，合理分配资源，确定复核频率和深度。

 

代表性抽样：对于大量备份的菌株，需制定科学的抽样方案进行复核。

 

技术更新：随着鉴定技术的发展，规程中采用的方法应适时更新，以提高效率和准确性。

 

人员培训：所有执行复核的人员必须经过充分的培训和考核，具备相应的技能和知识。

 

审计：应定期对复核过程进行内部或外部审计，确保持续符合规程要求。

 

这份规程提供了一个全面的框架。在实际应用中，务必根据您机构的具体情况（规模、资源、保藏菌种类型、遵循的标准等）进行细化和补充，制定详细的SOP来支撑每个复核步骤。

 

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