微生物限度检测样品不完全溶解的处理方法与操作步骤！

 

百欧博伟生物：在微生物限度检测中，遇到样品不完全溶解的情况确实比较常见，特别是对于脂溶性基质、高分子材料或某些特殊配方的样品（如软膏、油剂、某些原料药、化妆品、医疗器械浸提液等）。处理的关键在于既要保证样品的均匀分散/溶解以提供具有代表性的测试样本，又要确保处理过程不会对样品中可能存在的微生物造成不可接受的损伤（杀死或抑制）。

 

以下是一些处理策略和步骤，请根据你的具体样品特性和检测标准选择并验证：

 

1、评估原因与性质：

 

什么成分不溶？ 是油脂、蜡质、高分子聚合物、不溶性粉末（如某些矿物粉）还是其他？

 

不溶物的状态？ 是悬浮颗粒、乳化块、沉淀还是油水分层？

 

检测标准允许的范围？ 查阅你遵循的特定药典或标准中关于样品制备和处理的规定。

 

首选策略：优化溶解/分散条件 (温和处理)：

 

延长搅拌/振荡时间：在初始溶解步骤中，适当延长机械搅拌（如旋涡混合器）、振荡（如水平振荡器）或超声处理（谨慎使用）的时间。确保温度保持在室温或标准规定的温度（通常25±1°C），避免过热杀死微生物。

 

提高温度（谨慎且需验证）：对于某些熔点稍高于室温的油脂或蜡质，可以在严格控制的较低温度（如不超过40-45°C，绝对避免超过45°C）下短暂加热助溶，并立即冷却至检测温度。必须通过方法适用性试验（回收率试验）验证此步骤不会显著影响微生物回收率。对于绝大多数微生物限度检测，不建议加热。

 

2、选择合适的稀释剂/溶解介质：

 

加入表面活性剂/乳化剂：这是处理油脂、油膏、软膏等最常用且有效的方法。在稀释液（如胰酪大豆胨液体培养基、pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.1%蛋白胨水等）中加入适量的、对微生物无毒或低毒的表面活性剂。

 

常用选择：聚山梨酯 80 (吐温 80)、聚山梨酯 20 (吐温 20)。浓度通常在0.1%到1% (v/v 或 w/v) 之间。必须通过方法适用性试验确定最佳浓度并证明其不影响微生物回收。

 

使用有机溶剂（极谨慎，需严格验证和证明无替代方案）：仅在绝对必要时，且确认对目标微生物无毒或毒性可接受、易挥发或易被后续稀释中和的情况下使用。例如，对于某些极难溶的原料药，可能先用少量无菌有机溶剂溶解，然后必须立即用足量的适宜稀释液（含中和剂如吐温80或卵磷脂等）进行高倍稀释（通常稀释倍数需足够大，如100倍或以上），使有机溶剂浓度降至对微生物无影响的水平（通常<1%）。此方法风险较高，必须进行充分的方法学验证（回收率试验），证明全过程对微生物无杀灭或抑制作用，并且是最后的选择。很多标准（尤其是药品）不推荐或禁止使用有机溶剂。

 

使用特殊溶解介质：例如，对于含羊毛脂的样品，有时使用含1%吐温80和1%卵磷脂的稀释液。卵磷脂有助于中和某些防腐剂和乳化。

 

3、物理分散/均质化 (适用于悬浮颗粒或软固体)：

 

机械均质：使用无菌的均质袋和拍打式均质器。将样品放入无菌均质袋中，加入适量稀释液（可含助溶剂），进行拍打均质。此法能有效破碎团块，分散不溶性颗粒，使微生物释放。需优化拍打时间和速度，避免过热。

 

研磨（谨慎）：对于非常硬的或难以均质的样品，可在无菌研钵中用无菌稀释液和无菌砂子进行研磨。需确保无菌操作，并验证研磨过程对微生物的影响。风险相对较高。

 

高速分散/匀浆（谨慎）：使用实验室高速分散机或匀浆机，必须严格控制转速和时间，避免剧烈剪切产热杀死微生物，并需验证。

 

4、处理不完全溶解/分散的样品：

 

保证充分混匀：无论采用何种方法处理，在取样进行测试（倾注平皿或薄膜过滤）之前，必须确保样品溶液/悬浮液被剧烈、充分地振摇或涡旋混匀，使微生物和不溶性物质尽可能均匀分布。

 

代表性取样：在混匀后立即吸取样品溶液。吸取时注意避免吸入大的气泡或漂浮的团块（除非团块是样品的一部分且需要测试），但应确保吸取的是包含悬浮颗粒的均匀混合物。

 

沉降法（风险较高，需验证）：如果大的不溶性颗粒确实存在且难以分散，而标准允许或没有更好办法，有时会让样品静置很短时间（如数秒），让大的、快速沉降的非目标颗粒沉降，然后立即吸取上清液进行测试。这存在微生物随颗粒沉降而导致低估的风险，必须通过方法适用性试验验证其回收率可接受。一般不推荐。

 

5、替代方法：薄膜过滤法：

 

如果样品的不溶性物质会干扰平皿计数（如在琼脂上形成覆盖层或与琼脂反应），或者即使经过上述处理仍无法获得澄清溶液但能形成可过滤的均匀悬浮液，薄膜过滤法通常是更优的选择。

 

将样品溶液/悬浮液（已充分混匀）通过无菌滤膜（孔径通常为0.45µm）。微生物被截留在滤膜上，不溶性物质大部分也会被截留或通过（取决于颗粒大小）。用适量的稀释液冲洗滤膜以去除残留的样品基质（尤其是可能有抑菌性的成分），然后将滤膜转移到琼脂平板上培养。

 

此法能有效消除不溶性物质对计数的干扰，尤其适用于抑菌性样品或含颗粒样品。但也需进行方法适用性试验，验证冲洗步骤能有效去除抑菌成分且不影响微生物回收。

 

6、至关重要的步骤：方法适用性试验（回收率试验）：

 

无论你采用上述哪种处理方式（加助溶剂、加热、均质、过滤等），都必须对处理后的整个检测方法进行适用性试验。

 

向经过处理的样品中加入一定量的代表性验证菌株（如金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲霉孢子悬液），然后按既定方法进行检测。

 

计算回收率：比较经样品处理后的微生物回收数与直接接种到稀释液/培养基中的微生物回收数。

 

要求：回收率通常应不低于70%（或符合所遵循标准的具体要求，如药典规定需证明试验组与对照组回收率比值在0.5-2.0之间）。

 

目的：证明你所采用的溶解/分散/处理方法没有对微生物造成不可接受的损伤，并且该方法能有效检出样品中可能存在的微生物。

 

7、总结与关键点：

 

优先尝试温和方法：延长搅拌、添加低浓度表面活性剂（如0.1-1% 吐温80）、机械均质/拍打。

 

谨慎使用加热和有机溶剂：仅在必要时，严格控温/浓度，并必须通过回收率验证。

 

充分混匀是核心：任何方法处理后，取样前必须剧烈振摇/涡旋混匀。

 

薄膜过滤法是重要备选：特别适用于干扰平皿计数或难以完全溶解但有悬浮液的样品。

 

方法适用性试验是强制要求：任何偏离标准溶解程序的步骤都必须经过严格的回收率试验验证其有效性，证明不影响微生物检出。

 

记录：详细记录样品处理的所有步骤、使用的助溶剂种类浓度、处理条件（时间、温度、速度等）以及方法适用性试验的结果。

 

请务必参考你所遵循的特定药典章节或相关ISO标准中关于样品制备和处理的详细规定和指导原则。在实施任何变更前，最好与实验室负责人或质量部门沟通确认。

 

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