真菌原生质体制备技术流程及质量控制与应用示例！

 

百欧博伟生物：真菌原生质体制备技术是通过去除真菌细胞壁获得仅由细胞膜包裹的活性原生质体的方法，广泛应用于遗传转化、细胞融合、基因编辑及生理生化研究。以下是详细技术流程及关键注意事项：

 

一、制备流程

 

1、材料准备

 

菌株选择：根据实验需求选择真菌（如酵母、丝状真菌）。

 

酶解液：含裂解酶（如裂解酶、纤维素酶、几丁质酶）、渗透压稳定剂（0.6-1.2 M山梨醇、蔗糖）、缓冲液（pH 5.8-7.0的磷酸盐）。

 

预处理试剂：β-巯基乙醇（破坏二硫键）、EDTA（螯合金属离子）。

 

其他：离心机、恒温摇床、无菌过滤器、显微镜。

 

2、菌体培养

 

菌丝体培养：丝状真菌接种于液体培养基，25-30振荡培养至对数生长期（12-48小时）。

 

孢子收集（可选）：用无菌水或缓冲液刮取孢子，过滤去除菌丝碎片。

 

3、预处理

 

菌丝/孢子用预处理缓冲液（含β-巯基乙醇）洗涤，室温孵育10-30分钟，软化细胞壁。

 

离心（3000-5000 rpm, 5分钟）去除预处理液，用渗透压稳定剂洗涤2-3次。

 

4、酶解

 

将菌体悬浮于酶解液中（酶浓度通常为10-20 mg/mL），30-37温和振荡（50-100 rpm）孵育1-3小时。

 

关键点：定时取样显微镜观察（40×物镜），细胞变圆且释放内容物表明成功。

 

5、终止与纯化

 

加入预冷的渗透压稳定剂终止反应，离心（2000 rpm, 5分钟）收集上清中的原生质体。

 

用高渗液（如山梨醇溶液）洗涤2-3次，去除残留酶和碎片。

 

6、保存

 

原生质体悬浮于含渗透压稳定剂的保存液（如0.6 M KCl），4短期保存（<24小时）或添加冷冻保护剂（如10%甘油）后-80长期保存。

 

二、关键影响因素

 

菌龄与状态：对数生长期的菌丝细胞壁更易降解。

 

酶的选择：

 

酵母：Zymolyase、Lyticase；

 

丝状真菌：裂解酶+纤维素酶混合（如裂解酶Lywallzyme + Cellulase Onozuka R-10）。

 

渗透压稳定剂：防止原生质体破裂，常用山梨醇、蔗糖（浓度需优化）。

 

酶解条件：温度、pH、时间需根据菌种调整，过长会导致细胞破裂。

 

三、质量控制

 

活力检测：台盼蓝染色（死细胞呈蓝色）或荧光素二乙酸酯（FDA）染色（活细胞发荧光）。

 

纯度评估：显微镜观察碎片残留量，或检测上清液中胞内酶（如乳酸脱氢酶）泄漏量。

 

得率计算：血球计数板统计原生质体数量，优化酶解条件以提高产量。

 

四、常见问题与解决

 

低得率：增加酶浓度、延长酶解时间或调整预处理条件。

 

原生质体破裂：检查渗透压稳定剂浓度，避免剧烈振荡。

 

残留细胞壁：尝试混合酶解（如添加几丁质酶）。

 

五、应用示例

 

遗传转化：PEG介导DNA导入原生质体。

 

细胞融合：聚乙二醇（PEG）诱导不同菌株原生质体融合。

 

细胞壁再生研究：观察原生质体在固体再生培养基上的壁重建能力。

 

通过优化酶解条件和严格操作，可高效制备高活力真菌原生质体，为后续研究奠定基础。

 

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