ATCC细胞的冷冻保存及解冻复苏的标准操作流程！

 

一、细胞冷冻保存（冻存）方法

 

1、准备工作

 

冻存液配制：含10% DMSO（二甲基亚砜）的细胞冻存培养基（常用配方：70%完全培养基 + 20%胎牛血清FBS + 10% DMSO），需新鲜配制并预冷（4）。

 

材料准备：冻存管（标记名称、日期、代次）、程序降温盒（或异丙醇冻存盒）、离心机、移液器、冰盒等。

 

2、操作步骤

 

细胞状态确认

 

冻存前确保细胞处于对数生长期，活力>90%，无污染。

 

细胞收集

 

消化细胞（胰酶或其他消化液），用完全培养基终止消化，离心（1000 rpm，5分钟），弃上清。

 

重悬细胞

 

用预冷的冻存液轻柔重悬细胞，调整细胞密度至1×10~1×10 cells/mL（高密度可提高复苏存活率）。

 

分装冻存管

 

将细胞悬液分装至冻存管（每管1~1.5 mL），避免气泡，旋紧管盖。

 

程序降温

 

标准程序：4 30分钟 → -20 2小时 → -80过夜 → 转移至液氮长期保存（-196）。

 

替代方案：使用程序降温盒直接放置于-80冰箱过夜，再转移至液氮。

 

3、注意事项

 

DMSO有毒性，操作需快速以减少细胞暴露时间。

 

避免反复冻融，冻存管直接投入液氮时需密封良好，防止爆炸。

 

记录冻存信息：细胞名称、代数、冻存日期、存放位置等。

 

二、细胞解冻复苏方法

 

1、准备工作

 

预热的完全培养基、水浴锅（37）、离心机、培养瓶/皿、移液器。

 

2、操作步骤

 

快速解冻

 

从液氮中取出冻存管，立即放入37水浴，持续轻柔摇晃至完全融化（约1~2分钟）。

 

稀释与离心

 

将细胞悬液转移至含5~10 mL预热的完全培养基的离心管中，轻柔混匀（稀释DMSO毒性）。

 

离心（1000 rpm，5分钟），弃上清。

 

重悬与接种

 

用新鲜完全培养基重悬细胞，接种至培养器皿，轻摇均匀。

 

根据细胞类型调整接种密度（如贴壁细胞可按原培养密度的2倍接种）。

 

培养观察

 

放入37、5% CO培养箱，24小时后更换培养基以去除死细胞和残留DMSO。

 

观察细胞贴壁、增殖及形态变化。

 

3、注意事项

 

解冻过程需快速，避免长时间暴露于高浓度DMSO。

 

若细胞复苏后存活率低，可尝试增加接种密度或添加细胞保护剂。

 

严格无菌操作，水浴锅需清洁或使用密封袋防止污染。

 

三、关键点总结

 

冷冻核心：缓慢降温（防止冰晶损伤细胞膜） + 保护剂（DMSO或甘油）。

 

解冻核心：快速融解（减少DMSO毒性） + 及时稀释。

 

存活率评估：复苏后可通过台盼蓝染色检测细胞活力，正常应>80%。

 

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