蜡样芽胞杆菌的活化、保存与鉴定操作步骤及注意事项！

 

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种革兰氏阳性、产芽孢的细菌，广泛存在于土壤、水及食物中。其活化、保存及鉴定是微生物学研究和检测中的关键步骤，以下为详细操作指南：

 

一、活化

 

活化是将保存的菌种恢复代谢活性并增殖的过程，通常从冻干菌种、甘油保存菌种或斜面保存菌种开始。

 

1、培养基选择

 

营养琼脂（NA）或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）：通用培养基，适合蜡样芽胞杆菌生长。

 

血琼脂平板：观察溶血特性（β-溶血）。

 

2、活化步骤

 

冻干菌种：无菌条件下加入适量液体培养基，复溶后涂布或划线接种至固体培养基。

 

甘油菌种：用接种环蘸取少量菌液，划线接种至平板，37培养18-24小时。

 

斜面菌种：挑取菌苔划线接种至新鲜培养基。

 

3、培养条件

 

温度：30-37（常规选择37）。

 

时间：18-24小时，观察乳白色、不透明、边缘不规则的菌落（可能伴随溶血环）。

 

二、保存

 

长期保存需避免菌种退化或污染，常用方法如下：

 

1、短期保存

 

斜面保存：接种至营养琼脂斜面，4保存，1-2个月传代一次。

 

半固体穿刺保存：穿刺接种至含0.5%琼脂的半固体培养基，4保存，可维持3-6个月。

 

2、长期保存

 

甘油冷冻保存：

 

将新鲜菌液与灭菌甘油混合（终浓度15-30%），分装至冻存管，-80保存（可存活数年）。

 

注意：甘油需高压灭菌（121, 20分钟），避免污染。

 

冻干保存：需专用冻干机，菌种与保护剂（如脱脂牛奶）混合后冷冻干燥，-80或液氮保存。

 

三、鉴定

 

蜡样芽胞杆菌的鉴定需结合形态、生化及分子特征，尤其需与近缘菌（如苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌）区分。

 

1、形态学鉴定

 

菌落特征：乳白色、边缘不规则、表面粗糙，部分菌株在血琼脂上呈现β-溶血。

 

显微形态：革兰氏阳性大杆菌（1-1.2 × 3-5 μm），芽孢呈椭圆形、位于菌体中央或近端（需芽孢染色确认）。

 

2、生化试验

 

溶血试验：血琼脂上β-溶血（多数菌株）。

 

动力试验：阳性（鞭毛运动，半固体穿刺呈扩散生长）。

 

其他关键试验：

 

硝酸盐还原：阳性

 

VP试验（Voges-Proskauer）：阳性

 

葡萄糖发酵：产酸不产气

 

卵磷脂酶试验：阳性（在含卵黄的培养基上形成乳白色沉淀环）。

 

3、分子生物学鉴定

 

16S rRNA基因测序：通用方法，但可能无法区分近缘种。

 

特异性基因检测：

 

gyrB（DNA旋转酶B亚基基因）

 

rpoB（RNA聚合酶β亚基基因）

 

ces基因（呕吐毒素基因，区分产毒株）。

 

PCR鉴定：针对蜡样芽胞杆菌特异基因。

 

4、商业鉴定系统

 

API 50CH（碳水化合物利用谱）或VITEK 2系统：快速鉴定，需结合数据库比对。

 

四、注意事项

 

生物安全：蜡样芽胞杆菌为条件致病菌，操作需在生物安全柜中进行，避免气溶胶产生。

 

芽孢处理：芽孢耐高温，灭菌需121高压20分钟以上。

 

交叉污染：严格区分实验区域，避免与炭疽芽胞杆菌混淆（需在高级别实验室操作炭疽杆菌）。

 

通过上述步骤，可系统完成蜡样芽胞杆菌的活化、保存及鉴定，确保实验结果的准确性和可重复性。

 

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