小鼠细胞分离液的制备方法与操作步骤及质量控制！

 

小鼠细胞分离液的制备与质量控制是细胞生物学和医学研究中的基础操作，需确保分离的细胞活性、纯度及功能完整性。以下是详细步骤及质量控制要点：

 

一、小鼠细胞分离液的制备

 

1、常用试剂选择

 

基础分离液：Hanks平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液，含Ca²/Mg²（维持细胞膜完整性）或无Ca²/Mg²（减少细胞聚集）。

 

酶解液：

 

胶原酶（/型）：适用于实体组织（如肝、肺、肿瘤）。

 

胰蛋白酶：用于贴壁细胞（如成纤维细胞）。

 

DNase：降解DNA减少细胞团黏连。

 

添加剂：2-10%胎牛血清或牛血清白蛋白，用于抑制酶活性并保护细胞。

 

2、操作流程

 

组织获取：

 

安乐死小鼠后迅速取材，置于预冷HBSS/PBS中。

 

剔除血管、脂肪等非目标组织。

 

机械解离：

 

剪碎组织至1-3 mm³碎块。

 

使用注射器活塞轻柔研磨或70 μm细胞筛过滤。

 

酶消化：

 

加入含酶的分离液（如0.1%胶原酶+0.01% DNase），37振荡消化10-30分钟。

 

每10分钟观察一次，避免过度消化（导致细胞死亡）。

 

终止消化：

 

加入含血清的培养基中和酶活性。

 

离心（300×g，5分钟）收集细胞，用PBS洗涤2-3次。

 

纯化：

 

密度梯度离心分离特定细胞亚群。

 

磁珠分选（MACS）或流式分选（FACS）提高纯度。

 

二、质量控制关键指标

 

1、细胞活性检测

 

台盼蓝染色：活细胞拒染，死细胞呈蓝色。活性需＞85%（理想＞90%）。

 

Calcein-AM/PI双染：流式细胞术量化活/死细胞比例。

 

2、纯度评估

 

流式细胞术：检测特定表面标志物。

 

免疫荧光/组化：验证目标细胞特异性标记。

 

3、无菌性检测

 

微生物培养：取分离液接种于LB培养基，37培养24-48小时，观察浑浊度。

 

支原体检测：PCR或Hoechst染色确认无污染。

 

4、功能性验证

 

增殖能力：CCK-8或EdU染色检测细胞生长。

 

特异性功能：如肝细胞白蛋白分泌、免疫细胞细胞因子释放。

 

5、其他参数

 

渗透压：270-310 mOsm/kg（与生理条件匹配）。

 

pH值：7.2-7.4（CO培养箱中需调整）。

 

内毒素检测：LAL法检测，要求＜0.1 EU/mL（尤其用于体内实验）。

 

三、常见问题与优化

 

1、低细胞活性：

 

缩短消化时间，预冷操作台，优化酶浓度。

 

避免反复离心，使用含BSA的缓冲液减少机械损伤。

 

2、杂质过多：

 

增加过滤步骤（40 μm滤网），或梯度离心去除红细胞/碎片。

 

3、微生物污染：

 

全程无菌操作，试剂过滤除菌（0.22 μm滤膜）。

 

4、细胞聚集：

 

加入DNase（10-100 U/mL）或EDTA（0.5-2 mM）。

 

四、注意事项

 

批次记录：记录分离液配制时间、浓度、操作人员，确保可追溯性。

 

个性化调整：不同组织（如脾脏、肿瘤、脑）需优化酶组合及消化时间。

 

冻存保护：若需保存细胞，使用含10% DMSO的冻存液，逐步降温至-80或液氮。

 

通过严格的质量控制，可确保分离的小鼠细胞适用于下游实验（如原代培养、移植、分子机制研究），提高实验结果的可靠性。

 

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