无菌细胞培养环境的实验设施与操作规范及防控措施！

 

百欧博伟生物：建立无菌无毒的细胞培养环境是细胞实验成功的关键，需从设施、操作、试剂及人员管理等多方面综合控制。以下是具体要求和措施：

 

一、实验设施与环境

 

1、无菌操作区

 

超净工作台/生物安全柜：所有细胞操作需在经高效空气过滤器净化的超净台或生物安全柜内进行，确保空气无菌（ISO 5级洁净度）。

 

定期消毒：操作前后用75%乙醇擦拭台面，紫外线照射30分钟以上（注意紫外线对皮肤和细胞的损伤）。

 

2、实验室分区

 

独立区域：划分清洁区（细胞操作区）、半污染区（试剂准备区）和污染区（废物处理区），避免交叉污染。

 

空气控制：实验室需维持正压环境，配备空气过滤系统，定期更换滤膜。

 

3、温湿度控制

 

温度稳定在25±2，湿度40%-60%，减少微生物滋生。

 

二、器具与试剂灭菌

 

1、培养器具处理

 

高压蒸汽灭菌：玻璃器皿、金属工具等需121、15-30分钟高压灭菌。

 

干热灭菌：160、2小时处理耐高温物品。

 

一次性耗材：优先使用预灭菌的离心管、培养皿等。

 

2、培养基与试剂

 

过滤除菌：液体试剂（如培养基、血清）通过0.22μm滤膜过滤。

 

无菌分装：试剂分装后标注日期，避免反复冻融污染。

 

三、无菌操作规范

 

1、人员防护

 

穿戴实验服、口罩、手套及帽子，操作前用75%乙醇消毒双手。

 

禁止在操作区说话、咳嗽或快速移动手臂，减少气流扰动。

 

2、操作流程

 

开启超净台风机10-15分钟后再开始操作。

 

试剂瓶开启前用乙醇灼烧瓶口，瓶盖内面朝上放置。

 

移液器吸头避免触碰非无菌表面，液体转移时斜持瓶身减少空气接触。

 

3、污染监控

 

定期检测：对培养基、PBS等留样进行微生物培养（37培养48小时），确认无菌。

 

细胞观察：每日显微镜检查细胞状态，发现浑浊、pH异常立即丢弃。

 

四、污染防控措施

 

1、交叉污染预防

 

不同细胞系分开操作，使用独立培养箱或分层放置。

 

细胞冻存时标注名称、日期，避免混淆。

 

2、消毒与废弃物处理

 

废液加入1%次氯酸钠浸泡后丢弃，污染器械高压灭菌处理。

 

定期用0.1%新洁尔灭或过氧化氢雾化消毒实验室。

 

五、人员培训与管理

 

1、规范培训

 

实验人员需通过无菌操作考核，熟悉应急预案（如支原体污染处理）。

 

建立SOP（标准操作程序），明确消毒频率、设备维护流程。

 

2、记录与追溯

 

记录细胞来源、传代次数、操作人员及异常事件，便于污染溯源。

 

六、常见污染源及应对

 

细菌/真菌：培养基浑浊，需丢弃并彻底消毒。

 

支原体：使用支原体检测试剂盒，污染后建议废弃细胞系。

 

交叉污染：STR鉴定细胞株，规范操作流程。

 

通过以上措施，可最大限度降低污染风险，为细胞提供稳定的生长环境。关键点在于严格的无菌意识、规范的流程执行以及系统性环境管理。

 

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