细胞培养基浑浊的原因排查与处理方法及解决方案！

 

细胞培养基出现浑浊并伴有细沙状物质，可能由多种原因引起。以下是逐步排查与解决方案：

 

一、初步观察与显微镜检查

 

1、步骤：

 

取少量浑浊培养基置于显微镜下（建议400倍以上观察）。

 

使用相差显微镜或染色（如革兰氏染色）辅助判断。

 

2、可能结果：

 

微生物污染：观察到运动的细菌（快速移动的小点）或真菌菌丝。

 

细胞碎片：不规则颗粒，伴随死细胞（台盼蓝染色可确认）。

 

沉淀：均匀的晶体或无运动颗粒。

 

黑胶虫污染（争议性）：极微小颗粒规律运动（需排除布朗运动）。

 

二、区分污染类型

 

情况一：微生物污染

 

特征：

 

培养基浑浊度快速加重（24-48小时），可能散发异味（细菌）。

 

显微镜下可见大量运动的微生物。

 

处理：

 

立即丢弃污染培养物，避免交叉污染。

 

彻底消毒培养箱（75%乙醇+紫外线照射）、操作台及实验器材。

 

检查试剂（尤其是血清、培养基）是否无菌，更换新批次试剂。

 

严格规范无菌操作（火焰消毒、缩短开盖时间等）。

 

情况二：细胞碎片

 

特征：

 

细胞状态差（贴壁率低、漂浮细胞多）。

 

台盼蓝染色显示高死亡率。

 

处理：

 

提高换液频率，清除碎片。

 

优化培养条件（调整血清浓度、pH、传代比例）。

 

检查细胞是否过度消化或机械损伤。

 

情况三：培养基沉淀

 

特征：

 

新鲜未使用的培养基静置后也出现浑浊。

 

沉淀可能因温度、pH波动或成分析出（如磷酸钙）。

 

处理：

 

重新配制培养基，确保成分完全溶解（37水浴助溶）。

 

过滤灭菌前检查是否澄清，使用0.22 μm滤膜。

 

避免反复冻融，分装保存培养基。

 

调整CO2浓度（如5%）以维持pH稳定，减少碳酸盐沉淀。

 

三、排除其他潜在因素

 

1、支原体污染检测：

 

使用PCR检测试剂盒或染色（荧光显微镜下观察细胞周围小颗粒）。

 

2、血清沉淀：

 

解冻血清时4过夜，离心去除沉淀后再使用。

 

3、添加剂兼容性：

 

某些药物（如两性霉素B）或抗生素可能导致沉淀，检查浓度及溶解方法。

 

四、预防措施

 

1、定期维护：

 

每月清洁培养箱水盘，更换灭菌水。

 

定期检测支原体（每1-2个月）。

 

2、试剂管理：

 

分装血清和培养基，避免反复冻融。

 

记录试剂批号，污染时追溯来源。

 

五、总结流程图

 

培养基浑浊 → 显微镜观察 →

 

  ├─ 微生物 → 灭菌处理，更换试剂

 

  ├─ 细胞碎片 → 优化培养条件

 

  └─ 沉淀 → 调整配制方法或成分

 

通过系统排查，可有效定位问题根源并针对性解决。若仍无法确定，建议使用新鲜培养基和细胞进行空白对照实验，逐步排除变量。

 

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