细胞培养中颗粒物产生的原因与应对方法及预防措施！

 

百欧博伟生物：在细胞培养过程中，颗粒物的产生可能由多种因素引起，可能影响细胞状态或实验结果的可靠性。以下是常见原因及应对方法：

 

一、常见颗粒产生的原因

 

1、细胞碎片

 

原因：细胞死亡或机械损伤（如吹打过猛、离心速度过高）导致细胞裂解。

 

表现：显微镜下可见不规则碎片，培养液轻微浑浊。

 

2、微生物污染

 

细菌污染：培养液明显浑浊，镜下可见快速移动的小颗粒。

 

真菌污染：出现丝状或团状漂浮物。

 

支原体污染：无明显浑浊，但细胞状态异常（如生长缓慢）。

 

3、血清或培养基沉淀

 

血清纤维蛋白析出：血清解冻不当（如反复冻融或高温解冻）导致纤维蛋白聚集。

 

培养基结晶：某些成分（如谷氨酰胺、碳酸钙）在低温保存时析出。

 

4、耗材碎屑

 

塑料器皿碎屑：低质量培养瓶/离心管在操作中产生碎屑。

 

滤膜残留：过滤培养基时滤膜破损或未彻底冲洗。

 

5、细胞分泌物

 

外泌体或囊泡：某些活跃分泌的细胞（如干细胞、肿瘤细胞）释放的纳米级颗粒。

 

二、鉴别颗粒来源的方法

 

1、显微镜观察：

 

低倍镜观察颗粒形态（规则结晶 vs 不规则碎片）。

 

高倍镜观察微生物运动性（细菌会游动）。

 

2、无菌测试：

 

取培养液接种至肉汤培养基，37培养24-48小时，检测是否浑浊。

 

3、支原体检测：

 

使用PCR试剂盒或Hoechst 33258荧光染色。

 

4、血清/培养基检测：

 

更换批次或品牌，观察是否仍有沉淀。

 

三、应对方法

 

1、针对细胞碎片

 

优化操作：轻柔吹打细胞，降低离心速度（建议100-200 ×g）。

 

提高细胞活力：更换新鲜培养基，调整传代密度，避免过度生长。

 

过滤：用40μm细胞滤网过滤细胞悬液。

 

2、针对微生物污染

 

严格无菌操作：超净台紫外灭菌30分钟，规范使用酒精灯。

 

抗生素处理（仅限轻微细菌污染）：

 

添加双抗（青霉素-链霉素，终浓度1%），但需注意抗生素可能抑制某些细胞生长。

 

丢弃污染样本：严重污染时需废弃细胞，彻底清洁培养箱。

 

3、血清或培养基沉淀

 

正确解冻血清：4缓慢解冻，分装保存，避免反复冻融。

 

预处理血清：使用前离心（2000 ×g, 5分钟）去除沉淀。

 

培养基预热：使用前37水浴预热并轻轻摇匀。

 

4、耗材质量问题

 

更换品牌：选择高质量无热原的培养瓶/离心管。

 

预冲洗滤膜：过滤培养基前用PBS冲洗滤膜。

 

5、外泌体或囊泡

 

差异离心法：低速离心（300 ×g）去除细胞碎片后，超速离心（10,000 ×g以上）去除囊泡。

 

使用外泌体清除试剂。

 

四、预防措施

 

定期维护设备：清洁CO培养箱水盘，避免真菌滋生。

 

分装试剂：血清、培养基分装后-20保存，减少反复冻融。

 

严格质检：新批次血清/培养基需预实验验证。

 

规范操作：避免金属工具刮擦培养瓶底部。

 

五、处理流程示例

 

发现颗粒 → 显微镜初步判断性质。

 

若怀疑污染 → 无菌测试 + 支原体检测。

 

确认原因 → 针对性处理（如换液、过滤、丢弃污染样本）。

 

预防复发 → 优化操作流程并记录。

 

通过系统排查和规范操作，可有效减少颗粒物的干扰，保障细胞培养的稳定性。

 

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