甘油菌种保藏的准备工作与具体操作步骤及注意事项！

 

甘油菌种保藏是一种常用的长期保存微生物菌种的方法，适用于细菌、酵母等微生物，通常保存在-80低温环境中。以下是具体步骤及注意事项：

 

一、准备工作

 

1、菌种活化

 

将待保存的菌种接种到合适的固体或液体培养基中，置于适宜温度下培养至对数生长期（通常12-24小时），确保菌体处于高活性状态。

 

2、材料与试剂

 

无菌甘油（终浓度建议15-30%，常用20%或30%甘油溶液）

 

无菌离心管、冻存管（建议1.5-2 mL规格）

 

无菌吸头、移液器、离心机

 

无菌生理盐水或液体培养基（用于稀释菌液）

 

标签纸、记号笔

 

二、操作步骤

 

1、制备甘油溶液

 

配制40%-60%的无菌甘油溶液（终浓度根据需求调整，例如：若混合比例为1:1菌液与甘油，则甘油溶液需配成30%-60%）。

 

灭菌方法：高压蒸汽灭菌（121, 15-20分钟）或过滤除菌（0.22μm滤膜）。

 

注意：甘油黏稠，灭菌后需充分摇匀。

 

2、制备菌悬液

 

液体培养菌：离心收集菌体（如3000-5000 rpm, 10分钟），弃上清，用无菌生理盐水或液体培养基重悬菌体至适当浓度（如OD600≈1.0）。

 

固体培养菌：刮取适量菌落，用无菌生理盐水或液体培养基制成均匀菌悬液（可用浊法调整浓度至约10^8 CFU/mL）。

 

3、混合菌液与甘油

 

将菌悬液与灭菌甘油按比例混合（如1:1混合，终浓度甘油为15%-30%）。

 

充分混匀，避免气泡产生。

 

4、分装与标记

 

将混合液分装至无菌冻存管中，每管0.5-1 mL（避免装满，防止冻存时体积膨胀）。

 

用记号笔清晰标注菌株名称、保存日期、甘油浓度等信息。

 

5、冷冻保存

 

直接冷冻法：将冻存管直接放入-80冰箱保存（适用于大多数微生物）。

 

梯度降温法（可选）：若菌种对低温敏感，可先在4放置30分钟，再转入-20 1-2小时，最后转移至-80。

 

三、复苏菌种

 

从-80取出冻存管，迅速置于37水浴中轻摇至融化（约1-2分钟）。

 

用无菌吸头吸取适量菌液，接种至新鲜培养基中培养。

 

观察菌种活性，验证保存效果（如菌落形态、生长速度等）。

 

四、注意事项

 

1、无菌操作：全程在超净台或酒精灯旁操作，避免污染。

 

2、甘油浓度：

 

浓度过高（＞30%）可能抑制菌体活性，浓度过低（＜15%）无法有效防冻。

 

不同菌种对甘油耐受性不同，需预实验优化。

 

3、菌体状态：确保菌种处于对数生长期，活力最佳。

 

4、避免反复冻融：分装时建议小体积保存，每管仅解冻一次。

 

5、长期监测：定期检查保存菌种的存活率（如每1-2年复苏一次）。

 

五、适用性

 

1、适用菌种：细菌、酵母等（部分霉菌或严格厌氧菌需优化方法）。

 

2、保存时间：-80下通常可保存1-5年，具体因菌种而异。

 

通过以上步骤，可高效保存菌种，为后续实验提供稳定可靠的菌源。

 

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