病毒载体感染目的细胞的操作指南及注意事项有哪些？

 

百欧博伟生物：使用病毒载体感染目的细胞是分子生物学和基因治疗中常用的技术，主要用于基因传递、基因编辑或功能研究。以下是详细的操作步骤和注意事项：

 

一、病毒载体选择

 

根据实验目的选择合适的病毒载体类型：

 

1、腺病毒（Adenovirus）：感染分裂和非分裂细胞，瞬时表达（不整合到基因组）。

 

2、腺相关病毒（AAV）：低免疫原性，长期表达（需辅助病毒），适合体内实验。

 

3、慢病毒（Lentivirus）：感染分裂和非分裂细胞，整合到基因组，稳定表达。

 

4、逆转录病毒（Retrovirus）：仅感染分裂细胞，整合到基因组。

 

二、实验前准备

 

1、细胞准备：

 

确保目的细胞处于对数生长期（70-90%汇合度）。

 

提前更换新鲜培养基（避免抗生素，可能影响病毒感染效率）。

 

2、病毒储存与稀释：

 

病毒液分装后保存于-80，避免反复冻融。

 

使用前在冰上缓慢解冻，稀释时用含血清或（增强感染）的培养基。

 

三、感染步骤

 

1、预实验优化：

 

确定MOI（Multiplicity of Infection）：通过梯度稀释病毒（如MOI=1, 5, 10）测试，选择既能高效感染又避免细胞毒性的条件。

 

检测细胞敏感性：某些细胞（如原代细胞）可能需要更高MOI或增强剂。

 

2、正式感染流程：

 

将稀释后的病毒液加入细胞培养基中，轻柔混匀。

 

离心感染法（提高效率）：

 

加入病毒液后，将培养板在37、1000×g离心30分钟。

 

继续培养4-6小时或过夜后更换新鲜培养基。

 

常规感染法：

 

直接加入病毒液，37孵育12-24小时。

 

更换含正常培养基继续培养。

 

3、时间控制：

 

表达时间因病毒而异（如慢病毒需48-72小时，腺病毒24-48小时）。

 

四、感染后检测

 

1、荧光标记检测：

 

若病毒携带GFP/RFP等报告基因，通过荧光显微镜观察感染效率。

 

2、qPCR或流式细胞术：

 

定量检测目标基因的表达水平。

 

3、功能性验证：

 

如基因敲除/过表达后检测表型变化（Western blot、细胞增殖等）。

 

五、注意事项

 

1、生物安全：

 

慢病毒、逆转录病毒需在BSL-2级实验室操作。

 

穿戴防护装备（手套、护目镜），废液需消毒处理。

 

2、污染控制：

 

使用无菌技术避免细菌污染。

 

3、细胞状态：

 

细胞密度过高或状态不佳会显著降低感染效率。

 

4、增强剂使用：

 

可提高慢病毒/逆转录病毒感染效率，但对某些细胞有毒。

 

六、常见问题与解决

 

1、感染效率低：

 

提高MOI或改用离心感染法。

 

使用增强剂。

 

2、细胞死亡：

 

降低病毒用量，缩短感染时间。

 

更换为低毒性的病毒载体。

 

3、无目标基因表达：

 

确认病毒是否携带正确的启动子（如某些启动子仅在特定细胞中激活）。

 

七、应用示例

 

基因治疗：用AAV载体递送凝血因子基因治疗血友病。

 

CRISPR编辑：慢病毒递送Cas9和sgRNA实现基因敲除。

 

体外研究：腺病毒过表达某信号蛋白研究其功能。

 

通过以上步骤，可高效、安全地利用病毒载体感染目的细胞。具体操作需根据实验目的和细胞类型灵活调整。

 

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