单细胞悬液的制备方法与注意事项及常见问题与解决！

 

百欧博伟生物：单细胞悬液的制备是细胞生物学、免疫学、基因组学（如单细胞测序）等领域的关键实验步骤，其核心是获得高活性、低聚集、无碎片的单细胞分散液。以下是详细的制备方法及注意事项：

 

一、制备流程

 

1、样本类型及预处理

 

（1）组织样本（如肿瘤、肝脏、脾脏等）：

 

快速取材：新鲜组织离体后立即置于预冷的PBS或细胞保存液（如DMEM/F12）中，减少细胞死亡。

 

去除杂质：剔除脂肪、血管、坏死组织，避免干扰解离。

 

机械剪碎：用无菌剪刀或刀片将组织切成1-3 mm³小块，增大酶接触面积。

 

（2）培养细胞（贴壁或悬浮）：

 

贴壁细胞：弃培养基→PBS轻柔洗涤→胰酶消化（含EDTA）→终止消化（含血清培养基）。

 

悬浮细胞：直接离心收集，避免过度离心（推荐200-300×g，5分钟）。

 

（3）血液或骨髓：

 

红细胞裂解：使用ACK裂解液（155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA）处理5-10分钟，离心去除红细胞碎片。

 

白细胞分离：Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。

 

2、细胞解离方法

 

根据样本特性选择机械法、酶消化法或联合法：

 

（1）机械法：

 

研磨法：组织块置于筛网（70-100 μm）上，用注射器活塞轻压研磨，PBS冲洗收集。

 

吹打法：用移液器反复吹打（避免气泡），适用较松散组织。

 

仪器辅助：组织解离仪程序化控制剪切力，提高一致性。

 

（2）酶消化法：

 

常用酶：

 

胶原酶（Collagenase I/IV）：分解胶原蛋白，适用于纤维化组织。

 

胰蛋白酶（Trypsin）：解离细胞间连接，需严格控制时间（通常5-15分钟）。

 

中性蛋白酶（Dispase II）：温和解离上皮细胞。

 

混合酶（如Liberase™）：商业试剂优化酶组合，减少细胞损伤。

 

优化条件：37水浴震荡（5% CO2环境可增强效果），每10分钟观察解离程度。

 

（3）特殊处理：

 

DNA酶I（10-50 U/mL）：消化释放的DNA，减少细胞粘连。

 

钙螯合剂（EDTA/EGTA）：破坏钙依赖性细胞连接，常与胰酶联用。

 

3、细胞纯化与过滤

 

离心洗涤：200-300×g离心5分钟，重复2-3次去除酶和碎片。

 

梯度离心：Percoll或Ficoll分离特定密度细胞（如去除死细胞）。

 

过滤：依次通过100 μm、70 μm、40 μm细胞筛，去除团块（过滤前用PBS润湿筛网减少细胞损失）。

 

4、细胞重悬与计数

 

缓冲液选择：根据下游应用选择：

 

PBS：通用型，但缺乏营养，不宜久存。

 

培养基（如RPMI 1640）：含营养物质，适合短期保存。

 

专用缓冲液（如1×PBS + 0.04% BSA）：减少细胞吸附。

 

活性检测：台盼蓝染色（活细胞拒染），活率需＞85%（单细胞测序要求＞90%）。

 

浓度调整：稀释至目标浓度（如流式：1×10/mL；10x Genomics：700-1200细胞/μL）。

 

二、关键注意事项

 

1、温度与时间控制：

 

酶解过程需严格计时，避免过度消化导致细胞膜损伤。

 

全程低温操作（冰上处理）可降低酶活，减少细胞死亡。

 

2、避免细胞结团：

 

使用不含Ca²/Mg²的缓冲液。

 

添加0.02% DNA酶I处理粘性DNA。

 

轻柔吹打时沿管壁缓慢操作，避免剪切力损伤。

 

3、特殊样本处理：

 

肿瘤组织：可能含大量坏死区，需优先剔除；部分癌组织需延长酶解至1-2小时。

 

神经元/原代细胞：对机械力敏感，建议低浓度酶（如0.25%胰酶）+短时消化。

 

植物细胞：需额外用纤维素酶和果胶酶处理细胞壁。

 

4、污染防控：

 

操作全程无菌（超净台、抗生素添加）。

 

红细胞裂解后需充分洗涤，避免残留裂解液抑制后续反应。

 

三、常见问题与解决方案

 

 

 

四、质量评估标准

 

形态观察：显微镜下细胞呈圆形，边缘清晰，无大量碎片。

 

活率检测：台盼蓝染色活细胞占比＞85%。

 

聚集度检测：流式细胞仪前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图呈单细胞分布，无显著聚团信号。

 

功能性验证：下游实验（如流式分选、单细胞转录组）成功率达标。

 

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