细胞转染效率的检测方法及操作步骤有哪些？

 

细胞转染效率的检测方法多样，选择取决于实验目的、可用设备及转染类型。以下是常用的检测方法及其特点：

 

一、荧光蛋白标记法

 

1、原理

 

通过转染携带荧光蛋白（如GFP、RFP）的质粒，直接观察荧光表达。

 

2、检测方法

 

荧光显微镜观察：快速直观，但需排除自发荧光干扰。

 

流式细胞术（FACS）：定量分析转染效率，统计荧光阳性细胞比例。

 

3、优点：操作简单，无需裂解细胞，适合活细胞动态观察。

 

4、缺点：需构建荧光标记载体，可能影响目标蛋白功能。

 

二、报告基因检测法

 

1、常用报告基因

 

荧光素酶（Luciferase）：通过底物裂解产生发光信号，灵敏度高。

 

β-半乳糖苷酶（LacZ）：通过X-gal染色显蓝色，显微镜下计数蓝色细胞。

 

分泌型碱性磷酸酶（SEAP）：检测培养基中的酶活性，无需裂解细胞。

 

2、检测步骤

 

裂解细胞后检测酶活性（如化学发光或比色法），计算转染效率。

 

3、优点：灵敏度高，适合高通量筛选。

 

4、缺点：需特定底物或设备，破坏细胞。

 

三、PCR与蛋白质水平检测

 

1、qRT-PCR

 

检测目标基因的mRNA表达量变化，适用于siRNA/miRNA转染效率评估。

 

需设计特异性引物，以内参基因（如GAPDH）标准化数据。

 

2、Western Blot

 

检测目标蛋白表达水平，适用于过表达或基因敲降实验。

 

需特异性抗体，步骤较繁琐。

 

3、优点：直接关联功能基因表达，结果可靠。

 

4、缺点：耗时长，不适合快速检测。

 

四、流式细胞术（无荧光标记时）

 

1、免疫荧光染色

 

使用荧光标记抗体靶向转染产物（如表面蛋白），通过流式定量。

 

2、适用场景：未携带荧光报告基因的质粒转染，或检测内源性蛋白表达。

 

3、优点：灵活，可结合多参数分析。

 

4、缺点：依赖抗体质量，需优化染色条件。

 

五、其他方法

 

1、免疫细胞化学（ICC）

 

通过抗体染色和显微镜观察，半定量评估转染效率。

 

2、抗生素筛选

 

利用抗性基因（如嘌呤霉素）筛选稳定转染细胞，间接评估效率。

 

3、纳米颗粒示踪

 

若使用脂质体或纳米材料转染，可标记载体并观察细胞摄取情况。

 

六、选择建议

 

快速定性：荧光显微镜或LacZ染色。

 

精准定量：流式细胞术或荧光素酶检测。

 

基因表达验证：结合qRT-PCR和Western Blot。

 

动态监测：活细胞荧光成像或SEAP检测。

 

根据实验需求灵活组合方法，例如先通过荧光初步筛选，再以流式或分子生物学方法确认，可提高结果的准确性。

 

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