蜂蜜曲霉的微生物培养方法与实验内容及注意事项！

 

蜂蜜曲霉是壳霉目杯霉科真菌。菌落在查氏琼腊上2512天直径50-56mm，气生菌丝少，边缘埋生型菌丝超越菌落面达4-5mm；菌落在麦芽汁琼脂上2512天直径70mm,中部较厚，质地絮状,有较多的分生孢子结构，微褐赭黄色，近于蜜黄色（Honey yellow，R. XXX）。

 

一、菌种简介

平台编号：Bio-65607

提供形式：冻干物

拉丁属名：Aspergillus Melleus

中文名称：蜂蜜曲霉

属名：Aspergillus

种名加词：melleus

其它中心编号：=IFO 4346

来源历史：←上海市工业微生物研究所(M267) ←日本IFO

收藏时间：2005.11.25

模式菌株：非模式菌株

主要用途：研究；生产

具体用途：转化孕甾酮为11α羟基。

特征特性：菌落稍呈局限形，赭色或浅黄色，基内菌丝无色或具不同程度的黄色，反面带黄褐色至绿褐色。分生孢子穗初球形，后裂成更多的直柱状团块；分生孢子梗黄色，有麻点；顶囊球形，壁厚，全部可孕；小梗双层，密集；分生孢子近球形，常略粗糙。    

生物危害程度：四类

致病对象：无

培养基：马铃薯提取液 1.0L，葡萄糖 20.0g，琼脂 15.0g，pH自然。[注] 马铃薯提取液：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。

培养温度：28

资源保藏类型：培养物

保存方法：真空冷冻干燥法

实物状态：有实物

共享方式：公益性共享；资源纯交易性共享；合作研究共享；资源交换性共享

源数据主键：40330

用途：研究；生产；转化孕甾酮为11α羟基。

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

 

二、形态特征

菌落在查氏琼腊上2512天直径50-56mm，气生菌丝少，边缘埋生型菌丝超越菌落面达4-5mm；有大量的菌核而使菌落面呈颗粒状，初为粉红色，后变成黄色、微褐黄色，近于锑黄色（Antimony Yellow，R. XV），或赭黄褐色（Ochraceous-Tawny ，R. XV），并有光泽；分生孢子结构少，不影响菌落外观，但中心相对较多，淡黄色，近于暖浅黄色（Warm Buff，R. XV）或浅赭鲑色（Light Ochraceous-Salmon, R. XV）；无渗出液；无气味；菌落反面浅褐黄到紫褐色。分生孢子头幼时呈放射状到近球形，直径达200μm，老时大头裂成几个柱状体，小头呈疏松的圆柱状或松散；分生孢子梗多发生于气生菌丝，少发生于基质，孢梗茎（150-）200-500μm×（3.2）5.0-9.0（-12）μm，大者直，小者弯曲，平滑或粗糙，老时均粗糙且呈褐色；顶囊球形，近球形或稍长形，直径8-20（-28）μm，大者全部表面可育，小者二分之一的表面或仅顶部可育；产孢结构双层：梗基6.0-24μm×2.5-12μm，瓶梗6.0-8．0μm×2.0-2.5μm；分生孢子多椭圆形，少球形或近球形，3.0-3.5μm×2.2-2.8μm，壁平滑；菌核近球形到椭圆形，500-800μm×400-650μm。

在查氏酵母膏琼脂上25 7大直径45-50mm，具少量放射状沟纹或平坦，中心有凸起，产生大量的菌核而呈颗粒状，红褐色，近于赭黄褐到肉桂褐色，（Ohraceous-Tawny- Cinnamon Brown，R. XV）；分生孢子结构稀少，不影响菌落外观，在中心部分相对较多，浅黄色，近于肉桂淡黄色（Cinnamon，Buff，R， XXIX）；无渗出液；无气味；菌落反面紫红色。

菌落在麦芽汁琼脂上2512天直径70mm,中部较厚，质地絮状,有较多的分生孢子结构，微褐赭黄色，近于蜜黄色（Honey yellow，R. XXX）；边缘分生孢子结构少，但有较多的菌核散生于基质表面，带赭黄色；无渗出液；具霉味，反面黄褐色。

 

三、微生物菌种的培养

1、孢子制备

放线菌孢子的制备

一般采用琼脂斜面培养基,培养基中含有一些适合产孢子的营养成分,如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1%,氮源不超过0.5%),碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境,不利于放线菌孢子的形成,氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下,干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28 ,少数为37 ,培养时间为5~14天。

霉菌孢子的制备

霉菌的孢子培养,一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖,而且这类培养基的表面积较大,可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25~28 ,培养时间为4~14天。

2、种子制备

摇瓶种子制备

摇瓶种子进罐,常采用母瓶、子瓶两级培养,有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基要求比较丰富和完全,并易被菌体分解利用,氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓,子瓶培养基浓度比母瓶略高,更接近种子罐的培养基配方。

种子罐种子制备

种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中,经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子,把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内,经过培养形成更多的菌丝,这样制备的种子称为二级种子,将二级种子转入发酵罐内发酵,称为三级发酵。同样道理,使用三级种子的发酵,称为四级发酵。

 

四、实验内容

1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查

2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物

3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查

4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌

 

五、保藏方法

1、传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6冰箱内保存。

2、液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3、载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4、寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5、冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速冻结（约-70）和液氮（-196）等保藏法。

6、冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

 

六、注意事项

1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用无菌吸管吸取 0.3- 0.5ml 的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 个平板，操作完毕后尽快置于厌氧环境下恒温培养；若需接种液体培养基，制作培养液时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养液中的氧气）；操作完毕尽快置于厌氧环境下恒温培养；若需要液体培养，制作培养液时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养液中的氧气。 经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间；若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

6）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理；

7） 打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

8）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。