百欧博伟生物教您如何选择最优的菌种保藏方法？

 

百欧博伟生物：菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种。而微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。

 

而微生物在保存过程中的存活率和寿命取决于哪些关键因素？

 

（1）悬浮液和复水液的成分，

 

（2）所用低温保护剂的类型，

 

（3）冷却和解冻的速率，

 

（4）培养物的生长阶段，

 

（5）细胞的大小和类型、脂质含量、水分含量以及初始细胞密度。

 

一、菌种保藏的方法

 

1、定期移植法

 

此方法有时也称为传代培养法，该方法是一般微生物实验室经常使用的保藏方法之一。根据不同微生物生长繁殖所需条件的不同，将需要保藏的菌种接种至适宜的斜面或者液体培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于 4～ 6条件下保存，保藏时间一般为 4 个月～ 6 个月，隔一段时间进行一次传代培养。应注意对于副溶血性弧菌等弧菌不可采用冷藏方法进行保藏。

 

优点是操作不复杂，观察方便，且对人员要求不高，一般微生物从业人员均可顺利完成，是微生物检测的基础操作。基本不需要特殊仪器设备，成本较低，应用范围广。

 

缺点是工作强度大，无法保存较长时间，需要频繁进行传代移植，而且在移植过程中极易造成污染和菌种的退化。

 

2、传代培养法

 

菌种斜面的保存

 

传代用菌种采用斜面冷藏保存。

 

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，在适宜温度下培养，生长充分后，转移至冰箱冷藏保存，以备实验传代用。此法用于实验用菌种的短期保存，随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常，灭菌处理后销毁。

 

保存时间与菌种类型有关，一般存储时间不超过 9 周，铜绿假单胞菌和分枝杆菌不超过 6 周，如保存期内，斜面出现缺水、干裂等情况，灭菌处理后销毁。菌种冻存管的保存

 

菌种可采用甘油、液体石蜡、瓷珠等方式冻存，根据其特性选择适宜冻存方法，常用方法见下方。冻存管注明菌种名称、菌种号、冻存日期等基本信息。菌种冻存管在-80保存不宜超过18个月。可间隔一段时间，将菌种冻存管复苏后，重新冻存。

 

3、真空冷冻干燥法

 

准备安瓿管用于冷冻干燥 菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，可用长颈球形底安瓿管或管状安瓿管，将安瓿管清洗干净，烘干，管口塞好脱脂棉塞，121 灭菌30 min，备用。

 

菌悬液的制备及分装在无菌条件下，用2 mL～3 mL脱脂牛乳将生长良好的纯菌培养物从斜面上洗脱下来，制成菌悬液，分装入安瓿管，每支安瓿管分装0.1 mL～0.2 mL。B.3.3 预冻 -80预冻1 h～2 h。

 

冷冻干燥 将冷冻后的安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8 h～20 h。终止干燥时间根据下列情况判断：a)安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；b)真空度接近空载时的最高值；c) 选用1～2支对照管，其中加水与菌悬液同量，若对照管中水份已干燥，视为干燥完结。

 

保存许多细菌、酵母和产孢真菌时，冻干效果较好，但对于非产孢真菌（营养菌丝）、某些种类的酵母（如Lipomyces、Leucosporidium、Brettanomyces、Dekkera、Bulleera、Sporobolomyces）和某些细菌[如Aquaspirillum serpens、Clostridium botulinum、Helicobacter pylori]的保存效果并不理想。在真空干燥过程中，冻干会对细胞产生压力，而在压力下培养的细胞可能对冻干有更好的适应性。采用真空冷冻技术，将菌种冷冻干燥成菌粉后长期保存。菌种管注明菌种名称、菌种号、日期等基本信息，-20±2冷冻保藏。

 

优点是保存期限长，可达到 10 年以上，且携带、运输方便，菌种的存活率和稳定性均较高。

 

缺点是对设备要求高，需要专业的冷冻真空干燥设备，投入相对较高；对人员操作水平要求高，操作方法相对繁琐，通常专业化的菌种保藏机构选用此种方法；冷冻干燥过程对菌体有一定损伤，需进行恢复培养。

 

4、甘油冷冻管保存法

 

用无菌接种环刮取平板或琼脂斜面的培养物，放入装有无菌纯化水的试管中，通过接种环与试管壁间的摩擦，使细菌充分扩散到纯化水中，制备成菌悬液。向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，充分混合后，分装于无菌小试管或冻存管，冷冻保存。

 

小提示：

 

一种说法，甘油管保藏菌种需要“慢冻快化”，即-80保藏前，先-20预冻，再放入-80保藏；取出使用时，直接放入37快速融化后使用。

 

另一种说法，甘油管保藏菌种需要“慢冻慢化”，即-80保藏前，先-20预冻，再放入-80保藏；取出使用时，逐级融化后使用。

 

实际使用时，甘油管直接-80冷冻保藏，使用时取出来直接用手捂热使用，也是符合第一种说法的。

 

效果到底哪种方式好，还需要继续研究，等待进一步数据。

 

每半年进行一次菌种确认试验，通过平板划线分离、观察菌落形态、染色镜检等常规实验检测细菌的存活情况。

 

5、液体石蜡保存法

 

无菌液体石蜡的制备选用优质化学纯液体石蜡，121 30 min压力蒸汽灭菌后，置40恒温箱中蒸发水分，备用。

 

液体石蜡管的制备 将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1 cm，使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20 冷冻或冷藏保存。

 

优点是保存时间相对较长，可达到 2 年～ 10 年，并且操作简单，使用方便，对于很多真菌的保藏也适用，可用于保存霉菌、酵母菌、放线菌及需氧菌，方法简便，可防止斜面干燥和氧气进入，但一些固氮菌、分枝杆菌、毛霉、厌氧菌等不适宜用此法。

 

缺点是对人员操作水平有一定要求，且操作强度大，成本高。在使用矿物油时要注意防止污染和防范火灾，且直立的试管需要对存放空间有较高要求，携带十分不便。

 

6、载体保藏法

 

此方法又称为干燥保藏法。一般会依据选择载体的不同，最常采用沙土管、明胶片、滤纸保藏法。对于产孢子或有芽孢的霉菌和放线菌都可以用这种方法进行保藏。

 

优点是操作简便，所需仪器设备简单，而且便于携带。

 

缺点是对营养细胞不适用，使用范围相对较窄。

 

7、液氮冷冻保藏法

 

此方法有时也称为液氮超低温冻结保藏法。将悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移至 -196的液氮或 -150的液氮气相中保存的方法。方法要求配备一些专用设备，如液氮冰箱、液氮储藏器等，需要使用甘油、吐温 80 等保护剂。此方法适用于支原体、衣原体等采用冷冻干燥法难以保藏的菌种，是很多菌种保藏机构选择较多的方法。

 

优点是菌种保藏时间较长，菌种存活率高，且不易发生变异及退化。

 

缺点是操作相对复杂，对人员操作水平要求高；设备昂贵，需要定期补充液氮，保藏成本高。同时需注意防爆危险的发生。

 

8、-80冰箱冻结法

 

此方法是将菌种悬浮于保护剂中置于 -80冰箱冻结保存的一种长期保藏菌种的方法，一般可保藏 2 年～ 5 年。

 

优点是使用较方便且保存时间较长。

 

缺点是不利于运输和携带，对设备要求较高，需要配备 -80的低温冰箱。

 

二、复苏与传代

 

以无菌操作方式开启冻干菌种管，加入适量培养液（按菌种选择培养液，如细菌选择营养肉汤、白色念珠菌选择沙堡液体培养基(SDA)、分枝杆菌选择苏通综合液体培养基(Sauton Broth Medium Base)、黑曲霉菌选择麦芽浸膏肉汤培养基（MEB 培养基），吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 mL～10.0 mL 相应培养液的试管，滴入少许菌种悬液，在适宜温度下培养（一般为 36±1 培养 18 h～24 h、黑曲霉菌为 30± 1 培养 42 h～48 h），此为第 1 代培养物。

 

用接种环取第 1 代培养物，或从菌种冻存管中取适量菌液/瓷珠，划线接种于相应培养基平板（按菌种选择培养基，如细菌选择营养琼脂培养基、白色念珠菌选择沙堡琼脂培养基(SDA)、分枝杆菌选择改良罗氏培养基（martin broth modified）或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂培养基、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基（MEA），在适宜温度下培养（一般为 36±1培养 18 h～24 h、分枝杆菌 36± 1培养 72 h、黑曲霉菌 30±1 培养 42 h～48 h），此为第 2 代培养物。

 

挑取第 2 代培养物中典型菌落，接种于相应培养基斜面或平板（按菌种选择培养基斜面，如细菌选择营养琼脂斜面、白色念珠菌选择沙堡琼脂(SDA)斜面、分枝杆菌选择改良罗氏培养基（martin broth modified）或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂斜面、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基（MEA）平板），在适宜温度下培养（一 般为 36±1培养 18 h～24 h、分枝杆菌 36±1培养 72 h、黑曲霉菌 30±1培养 42 h～ 48 h），此为第 3 代培养物。

 

取第 3 代培养物，接种于相应培养基斜面，在适宜温度下培养，此为第 4 代培养物。

 

按上述方法培养至所需代数，传代时在试管上注明菌种名称、菌种号、代数及传代日期等基本信息。

 

三、相关法规

 

在《2020中国药典》的9203 药品微生物实验室质量管理指导原则中就有说明，标准储备菌株保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装于小瓶中，建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于一30）等方法保存。低于-70或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时间。标准储备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。

 

《中国药典》2020年版三部 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制中菌毒种的保存

 

1、菌毒种经检定后，应根据其特性，选用冻干、液氮、≤－60冻存或其他适当方法及时保存。

 

2、不能冻干、液氮、≤－60冻存的菌毒种，应根据其特性，置适宜环境至少保存2份或保存于两种培养基。

 

3、保存的菌毒种传代、冻干、液氮、≤－60冻存均应填写专用记录。

 

4、保存的菌毒种应贴有牢固的标签，标明菌毒种编号、名称、代次、批号和制备日期等内容。

 

5、非生产用菌毒种应与生产用菌毒种严格分开存放。工作种子批与主种子批应分别存放。每批种子批应有备份，并应在不同地方保存。

 

从国家菌种库或合格的二级供应商处获取的原始菌种将在适当的培养基中复苏并生长。该库存菌种（首次传代或转接）的部分样本悬浮于冷冻保护剂中，分装至小瓶中，并在-30或以下温度冷冻保存，直至使用。如果保存在-70或以下温度或以冻干形式保存，菌株可无限期保存。这些冷冻库存可用于接种每月或每周的工作培养物。一旦打开，在工作悬浮液培养后，未使用的细胞悬浮液不应再次冷冻。应丢弃未使用的部分，以最大程度地降低库存失去活性和被污染的风险。

 

微生物菌种保藏的目标不仅是实现长期存活，还要保持其保存菌种的基因型和表型稳定性，因为基因型和表型的完整性对于验证以往的研究发现至关重要。

 

在保存前后，必须在形态学、生理学、免疫学和分子水平上对菌种进行全面表征。通常，对活性菌种进行亚培养会诱导更多突变。使用冻干和低温保存方法保存的菌种表现出更高的基因型和表型稳定性，但仍需优化以获得更好的结果。

 

有研究对木霉属（Trichoderma spp.）菌种保存后的基因组完整性进行了评估，结果表明，像低温保存这样稳健的方法有时也会诱发遗传改变。同样，有研究评估了细菌生物降解潜力的稳定性，并得出结论：“使用正确的保存方法和低温保护剂对于避免遗传改变至关重要。”

 

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