DNA凝胶回收试剂盒的知识与应用及操作步骤！

一、背景

DNA凝胶回收试剂盒采用温和的溶胶液，可以使琼脂糖凝胶完全融化，同时避免在高温下DNA发生脱嘌呤和末端水解，保持DNA完整的生物学活性。采用硅胶膜选择性吸附DNA的方法回收DNA，适合从TAE或者TBE琼脂糖凝胶中纯化回收多至4μg，长度介于50bp-10kb的DNA片段，回收率为90%.。纯化回收的DNA可直接酶切、连接、转化细菌、测序、PCR、杂交等后续操作。

二、操作步骤

1、将切割的凝胶转入预先称重的1.5ml离心管中，加入等体积的Buffer GL(100mg的凝胶加入100μl Buffer I)。放入55-60水浴中，间断摇晃混合，直至凝胶完全融化（约5-10min），放置使其冷却至室温。

2、将上述混合液加入DNA回收柱内，如果溶液体积>700μl，分次转移溶液；室温放置1-2min或更长时间。

3、在13000g离心1分钟，弃废液。目的DNA长度≤500bp时，离心结束后将收集管中的溶液再次转入DNA纯化柱中，离心。

4、在DNA纯化柱中加入650μl Wash Buffer，13,000g离心30秒，弃废液，将DNA纯化柱放回收集管。

5、重复步骤4。

6、13000g离心3 min，以去除柱中残余乙醇。

7、将纯化柱放入新的离心管中，向柱中加入在60下预热的30-50μl Elution Buffer或ddH2O，室温放置1-2min或更长时间。

注意：

a.加入Elution Buffer后将柱子整个温育5min后再离心洗脱可以增加DNA回收效率。

b.对大于8Kb的片段，加溶液Elution Buffer后将柱子整个温育15-30min可以提高回收效率。

8、13,000g离心1 min，所得液体即为高纯度DNA。

三、应用

用于类病毒cDNA体外连接产物回收中出现的非特异条带原因探究：

琼脂糖凝胶电泳是分子生物学试验中常用的DNA分析方法。本文通过琼脂糖凝胶电泳分析和回收啤酒花矮化类病毒（Hop Stunt viroid,HSVd）cDNA体外连接产物中二聚体时,常发现回收的二聚体产物中有单倍体和其他非目标条带存在,为了明确该现象发生的原因,开展了相关实验。

结果如下：

1、分别通过PCR扩增和体外连接获得HSVd cDNA单倍体、二倍体及二倍体以上的多聚体片段混合产物样品,通过琼脂糖凝胶电泳回收其中的二聚体,回收产物再经过聚丙烯酰铵凝胶（Polyacrylamide acrylamide gel,PAGE）电泳,结果显示,除了二聚体外,从两种产物中还回收到了单倍体和其他非目标条带。

2、通过体外连接,获得桃潜隐花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid,PLMVd）三个分离物和真菌TP-3-1延伸因子的单倍体、二倍体及二倍体以上的多聚体片段混合产物样品,然后通过琼脂糖凝胶电泳回收其二聚体,结果显示,对4个样品回收的二聚体产物中均存在单倍体和其他非目标条带。结果表明这种现象不仅存在HSVd的cDNA中,而且也存在于其他类型的DNA中,是一种普遍现象。

3、选取通过PCR获得的HSVd cDNA单倍体、二倍体及二倍体以上的多聚体片段混合产物,使用4种不同品牌的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收其二聚体,回收产物经PAGE电泳,结果显示回收产物中除二聚体外均有单倍体和非目标条带,表明这种非特异反应与选用的胶回收试剂盒品牌无关。

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