链霉蛋白酶E的知识与应用及使用方法！

一、背景

链霉蛋白酶E来源于灰色链霉菌的一组蛋白酶(Protease from Streptomyces griseus),至少包含细胞外丝氨酸蛋白醇在内的三种蛋白酶活性。通常情况，丝氨酸蛋白酶具广谱的底物特异性，通过分子上一一个天冬氨酸，一个组氨酸，和一个丝氨酸组成的活性位点来调控。本酶选择性偏好水解谷氨酸或天冬氨酸羧基形成的肽键，常见的丝氨酸活性位点抑制剂可抑制其活性，如PMSF和DFP。链霉蛋白酶E(PronaseE)，还至少包含三种酪蛋白水解活性和一种氨基肽酶活性，这种酪蛋白水解酶分别命名为灰色链霉菌来源蛋白酶A(Streptomyces gniseus Protase A)，蛋白酶B(Streptomyces griseus Protease B)和胰酶(Sreptomyces griseus TIrypsin)。

链霉蛋白酶E可用于蛋白的大量或者完全降解，还可用来研究蛋白酶抑制剂，以及热失活动力学。本制品常用于核酸分离步骤，在添加0.2%SDS和10 mM EDTA的体系内孵育0.5-3h即可达到目的。因其比已知的碱性蛋白酶在更高pH环境下，甚至0.2N NaOH溶液中，活性更强，因此非常适合不溶性蛋白的酶解实验，以及蛋白结构分析。另，还可与胶原酶和胰酶联合使用，以消化组织。也可作用纯化糖蛋白生产糖肽。

二、使用方法

[注意]:本品应用非常广泛，具体的使用方法和工作浓度请根据实验经验或参考文献来调整。

1、储存液制备:溶解于去离子水，配制成5-20mg ml的储存液，若用于DNA或RNA分离步骤，建议将溶液56°C加热处理15min,之后37°C孵育1h,此步骤能促使酶发生自消化，以去除DNase和RNase污染。之后将储存液分成单次用量，-20°C冻存，通常情况1年稳定。

2、DNA分离:直接加入DNA制备体系(含有0.5-1%SDS以打破DNA-蛋白相互作用)，典型工作浓度范围250-500μg蛋白/ml,于37°C孵育1-4h。[注意:建议工作浓度范围在250-2000g/ml,依照具体情况而定]。

3、蛋白水解:溶解约0.2uM蛋白到0.2ml 50mM碳酸氢铵缓冲液，pH8.0(或磷酸盐缓冲液，pH7.0)，之后按照1%(w/w)加入Pronase E,于37°C孵育24h。根据情况，有可能需要添加4%(w/w)氨肽酶M，并于37°C再孵育18h。

三、应用

链霉蛋白酶E可以用于胃镜检查前联合应用链霉蛋白酶与西甲硅油的有效性研究：

明确胃镜检查前联合应用链霉蛋白酶与西甲硅油的有效性,为胃镜检查前联合使用链霉蛋白酶、西甲硅油的必要性提供有力依据。

方法：选取655例行胃镜检查的患者,随机分为两组:试验组,检查前20分钟予链霉蛋白霉20000u+1g碳酸氢钠溶于50mL温水联合西甲硅油10mL口服,检查前10分钟予利多卡因胶浆1支含服;对照组,仅检查前10分钟予利多卡因胶浆1支含服。以镜下早期胃癌检出率为研究主要观察终点;患者用药后不适反应发生情况,胃镜下胃黏膜可视度评分、胃镜检查过程中需冲洗次数、操作时间及微小病灶检出情况为次要观察终点。

分别统计两组的观察终点指标,通过spss21.0软件进行对比分析。结果本研究共纳入655例胃镜检查患者,有5例因胃潴留、依从性差未完成研究终点指标等原因脱落,最终有650例患者完成本研究,试验组322例,对照组328例。

本研究中,试验组患者用药后的不适反应发生情况与对照组无明显差异(P=0.124)。试验组胃黏膜可视度总评分均值为5.72±1.25,对照组胃黏膜可视度总评分均值为6.78±2.25,试验组胃黏膜可视度总评分均值明显低于对照组,即试验组镜下胃黏膜清晰度优于对照组(P<0.001)。试验组中,患者胃镜检查过程中有64例需冲洗1-2次,2例需冲洗至少3次,而对照组中分别为173例、35例,在胃镜检查过程中胃黏膜需冲洗的次数明显比试验组多(P<0.001)。

试验组平均胃镜检查操作时间为176.15±28.92秒,对照组平均胃镜检查操作时间为181.84±50.83秒,试验组平均胃镜检查操作时间与对照组相比无显著差异(P=0.078)。微小病灶中,溃疡、出血点类病灶在试验组中的检出率分别为12.7%、3.1%,在对照组中为7.3%、0.6%,试验组中检出率比对照组中高(P=0.021,P=0.018)。

试验组322例病例中,有7例镜下检出且病理明确诊断的早期胃癌病例,对照组无镜下检出且病理明确诊断的早期胃癌病例(P=0.007)。

结论：胃镜检查前联合使用链霉蛋白酶、西甲硅油对于祛除胃黏膜上的黏液及泡沫,提高胃黏膜视野的可见度有效,有利于对微小病灶及早期胃癌的检出。