外泌体膜标记荧光试剂盒的知识与研究应用！

一、背景

外泌体膜标记荧光试剂盒是利用被荧光标记的亲脂性的染料和膜渗透型的化合物对对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪的科研试剂盒。Exosome（外泌体）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；参与细胞之间的交流，物质的运输以及正常生理过程的维持，此外还与疾病的产生有关。

外泌体膜标记荧光试剂盒根究标记物染色方法有以下几种：

1、亲脂性染料:PKH-67（green）/PKH-26（red）

染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。

2、亲脂性羰花青染料（carbocyanine dyes）:DiI/DiD/DiO/DiR

DiI,DiO,DiD,DiR是一系列亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。这些环境敏感性荧光染料在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。一旦进入细胞膜后，可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。

外泌体膜标记荧光试剂盒根究标记方法有以下几种：

1、CFSE：

羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，常称为CFSE，可被动扩散进入细胞。这种试剂没有颜色和荧光，直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团，产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物。

2、Calcein-AM：

在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。

3、利用外泌体表面的巯基（thiol group）对外泌体进行标记

二、应用

外泌体膜标记荧光试剂盒仅限在用于外泌体相关的科研研究：

在血浆外泌体源性miR-122-5p和miR-300-3p作为诊断大鼠短暂性脑缺血发作潜在标记物的研究中以血浆外泌体源性rno-miR-122-5p和rno-miR-300-3p在大鼠短暂性脑缺血发作的标记物。用外泌体膜标记荧光试剂盒对大鼠大脑中动脉阻塞模型中的血浆外泌体源性miR-122-5p和miR-300-3p进行检测。

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