人视网膜母细胞瘤的应用及培养操作方法！

一、背景

人视网膜母细胞瘤是1974年R.M.McFall和T.W.Sery建立的两株人眼癌细胞系中的一株。细胞能在Difco Bacto-Agar中存活但不形成克隆。扫描电镜显示在表面囊泡，板状伪足和微绒毛在数量上和频率上的改变。细胞分化研究，肿瘤治疗的动物模型和生化评价都涉及这株细胞。

二、人视网膜母细胞瘤细胞培养方法

1、人视网膜母细胞瘤细胞传代：人视网膜母细胞瘤细胞密度达到80-90%时即可传代

弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量人视网膜母细胞瘤细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

将人视网膜母细胞瘤细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、人视网膜母细胞瘤细胞复苏：

将冻存管在37温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将人视网膜母细胞瘤细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、人视网膜母细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

1-2min后，显微镜下观察人视网膜母细胞瘤细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

将人视网膜母细胞瘤细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

将冻存管放入程序降温盒，放入-80冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

三、应用

人视网膜母细胞瘤可以用于双氢杨梅树皮素诱导人视网膜母细胞瘤细胞氧化及凋亡的研究：

通过检测双氢杨梅树皮素(APS)对体外培养的人视网膜母细胞瘤细胞株(HXO-RB44)增殖的影响,观察细胞凋亡、线粒体跨膜电位、细胞内活性氧(ROS)的变化,探讨APS诱导人视网膜母细胞瘤(RB)细胞凋亡的氧化作用机制。

方法：取对数生长期的人HXO-RB44进行实验。

1、观察APS干预下细胞的生长曲线:设7个不同药物浓度(50.00、33.33、22.22、14.84、9.90、6.60、4.40)μg/ml和空白对照组,分别作用0、24、48、72h后,绘制生长曲线图。

2、观察APS对细胞增殖的抑制作用:7个浓度的APS干预RB细胞24h后,观察其形态学变化,MTT法、软琼脂克隆形成法观察RB细胞的体外抑制作用。

3、AO/EB染色观察细胞凋亡形态学变化:选取3个不同浓度(50.00、14.84、4.40)μg/ml的APS干预RB细胞24h后,染色,荧光显微镜观察,并拍照。

4、流式细胞仪检测细胞凋亡:设3个药物浓度组(50.00、14.84、4.40)μg/ml和空白对照组,作用24h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。5.流式细胞仪检测线粒体跨膜电位及ROS的变化:选取对数生长期细胞培养,设3个药物浓度组和空白对照组培养24h后,染色,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位及ROS的变化。

结果：

1、APS干预后,RB细胞的生长受到明显抑制,随着药物浓度的增加呈剂量依赖性;作用24h时抑制作用最明显。

2、通过倒置显微镜可观察到RB细胞出现形态学的变化。细胞的IC50为14.71μg/ml;药物浓度为9.9μg/ml以上时单细胞克隆形成抑制率为100﹪,药物浓度为4.4μg/ml,抑制率为52.2﹪。

3、AO/EB荧光染色,药物作用后出现了明显的凋亡细胞,表现为细胞皱缩、核染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征性的形态学改变。

4、APS对细胞凋亡有明显的诱导作用。药物作用24h后的凋亡率分别为88.13%、58.46%、14.83%,各浓度组凋亡率与空白对照组(4.82%)比较,差异均有显著性(P<0.05),各浓度组细胞凋亡率之间差异也均有显著性(P<0.05)。

5、APS能降低RB细胞线粒体跨膜电位。APS处理24h后不同浓度组(50.00、14.84、4.40、0)μg/ml的平均荧光强度分别为20.70、55.63、88.57和146.53,药物组与空白对照组比较差别有统计学意义(P均<0.01),三个浓度之间差异有统计学意义(P<0.01)。

6、APS能促进RB细胞内ROS的产生。APS处理24h后不同浓度组(50.00、14.84、4.40、0)μg/ml的平均荧光强度分别为54.87、43.03、36.80和20.93,药物组与空白对照组比较差别有统计学意义(P均<0.01),三个浓度之间差异有统计学意义(P<0.01)。