人咽鳞癌细胞的复苏与传代及冻存操作说明！

一、背景

人咽鳞癌细胞是1968年从一位印度下咽骨肿瘤患者的钻孔活组织切片中建立了FaDu细胞株。在建立的细胞株中发现细胞质中含有成束的细丝，并且细胞分界上的桥粒特别突出。

二、人咽鳞癌细胞操作流程

1、收到人咽鳞癌细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

2、人咽鳞癌细胞传代：

1）人咽鳞癌细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、人咽鳞癌细胞冻存：

1）人咽鳞癌细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-201.5h，然后将其移入-80过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80。

4、人咽鳞癌细胞复苏：

1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2）将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm2培养瓶，于37，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

三、应用

人咽鳞癌细胞可以用于外泌体运载的TRPP2 siRNA抑制咽鳞癌细胞的上皮—间质转变：

近年来放疗、化疗、免疫治疗以及外科手术已广泛应用于头颈癌的临床治疗中,但由于癌细胞容易转移,头颈部恶性肿瘤的治疗效果仍不理想。其中,上皮-间质转变是肿瘤细胞转移过程中的重要一环。TRPP2(瞬时电位通道)信号通路已经被证明可以通过调节喉鳞状细胞癌的EMT(上皮-间质转变)过程来增强癌细胞的侵袭与迁移。这一发现为肿瘤的临床治疗提供了新的思路。

探讨外泌体/TRPP2 siRNA复合物是否可以通过抑制TRPP2表达来影响FaDu(人咽鳞癌细胞)细胞的上皮-间质转变过程。

方法：

1、外泌体与TRPP2 siRNA结合使用外泌体提取液和高速离心的方法提取人胚肾293细胞(HEK-293)外泌体,用琼脂凝胶电泳法检测TRPP2 siRNA与外泌体是否稳定结合。

2、观察外泌体/TRPP2 siRNA复合物在FaDu细胞中的分布使用荧光显微镜观察被荧光染料标记的外泌体及TRPP2 siRNA,以确定外泌体/TRPP2 siRNA复合物是否被FaDu细胞摄取。

3、检测TRPP2、vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白在被外泌体/TRPP2siRNA复合物转染后的FaDu细胞中的表达使用Western blotting的方法检测TRPP2,vimentin,N-cadherin和E-cadherin蛋白的表达水平,以确定转染后的FaDu细胞的TPRR2通道及EMT过程是否受到影响。

结果：

1、外泌体能与TPRR2 siRNA稳定结合。

2、外泌体/TRPP2 siRNA复合物能被FaDu细胞大量摄取。

3、外泌体/TRPP2 siRNA复合物能使转染的FaDu细胞EMT过程减弱。结论外泌体/TRPP2 siRNA复合物可以被FaDu细胞摄取并显著影响其TRPP2表达和EMT过程,外泌体/TRPP2 siRNA复合物有望成为头颈肿瘤治疗的新的方向。