树突状细胞的功能测定与制备方法及注意事项！

树突状细胞（dendritic cells,DC)是目前所知的功能最强的抗原呈递细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC参与免疫应答的启动和调节，在肿瘤学及其他学科的作用也日益受到重视。人外周血中DC含量很少，仅占单个核细胞的0.1％～1%。利用细胞黏附和密度梯度离心的方法虽然可分离纯化外周血树突状细胞，但此法分离的DC，不仅纯度低，数量少，而且处于不同的分化阶段，已难以满足临床研究的需要。随着人们对DC发生学的认识不断深入，许多学者开始用多种细胞因子诱导不同的前体细胞沿着不同的分化途径在体外扩增DC。

一、人外周血单个核细胞诱导DC

外周血中DC前体（CD34+细胞）有进一步分化的潜能。在外周血单个核细胞体外培养中，添加一定剂量的粒细胞单核细胞一集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-4(IL-4),DC前体细胞可分化成树突状细胞，而仅在GM-CSF条件下培养，则该前体细胞分化成巨噬细胞。IL-4具有抑制巨噬细胞生长的作用。加入TNF-α共同培养，可促进DC的成熟。

（一）材料

1、分离外周血单个核细胞所需试剂；

2、10% FCS的RPMI 1640培养液；

3、IL-4,GM-CSF,TNF-α。

（二）方法

1、常规方法分离外周血单个核细胞，并通过玻璃吸附法获得单核细胞。

2、用10% FCS的RPMI 1640培养液悬浮细胞，调细胞浓度为106/ml。

3、将单核细胞悬液加入24孔培养板中，1 ml／孔，并加入IL-4(50ng）与GM-CSF(100ng),置37,5% CO2培养箱中培养，3天后用含有IL-4与GM-CSF及10% FCS的RPMI 1640培养液半量换液。

4、培养7天后，换用含TNF-α 20ng/ml的RPMI 1640培养液继续培养2～7天后显微镜下观察，可见树突状细胞比淋巴细胞大，直径在10～20um之间，有许多刺状突起，分布于细胞表面。

（三）结果

收集悬浮细胞，洗涤后重悬于RPMI 1640培养液中备用。

（四）注意事项

1、进行半量换液时，注意不要将细胞吸出。

2、可以用IL-13替代IL-4，与GM-CSF构成联合培养体系。因其与IL-4具有相似的性质。

3、DC细胞尚无特异性标记，上述分离细胞表面标记应为CD3（-）、CD4（-）、CD8（-）、CD19（-）,CD21（-）,CD16（-）,CD14（-）和MHC-（+），可以用FCM或免疫荧光法分析鉴定。

二、DC的功能检测

DC在分离过程中和分离后，只要与培养器皿接触发生黏附，即可被活化，此时检测到的细胞功能已不准确；此外，通过分离获得的DC，其中包含功能各不一致的多种群体。因此，对DC功能的检测尚无统一的方法。目前检测DC功能的方法有：

1、DC抗原捕获能力的检测，收集DC，配成1x106/ml细胞悬液，取100ul加入等量FITC标记的葡聚糖，37静置60分钟，PBS洗两次，用流式细胞仪检测信号强度。

2、利用混合淋巴细胞培养（MLC)的方法检测DC的功能，如果能增强MLC，说明DC具有呈递抗原的作用。但这仅仅能反映一部分DC的功能，有部分DC具有诱导特异性免疫耐受的作用，因此不能增强MLC的反应强度，反而抑制MLC的反应强度。

3、采用特异性抗原预处理DC后，再与淋巴细胞孵育，观察淋巴细胞的增殖情况，由于对特异性抗原发生免疫应答的淋巴细胞较少，故一般只有采用3H-TdR掺入等敏感的方法检测。

4、利用某些刺激剂，如金黄色葡萄球菌，可以刺激DC分泌IL-12，通过检测DC分泌的IL-12的量来反映DC的功能。