人沙眼衣原体(CT)ELISA KIT的实验原理与操作步骤！

一、背景

人沙眼衣原体(CT)ELISA KIT是利用ELISA法定量测定血清、血浆或其它相关液体中沙眼衣原体(CT)含量。

二、实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中沙眼衣原体(CT)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入沙眼衣原体(CT)抗原、生物素化的抗沙眼衣原体(CT)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的沙眼衣原体(CT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

三、操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37,60分钟。

3、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4、每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37，60分钟。

5、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6、依序每孔加底物溶液90ul，37避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7、依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

四、应用

用于CT259、CT703基因在沙眼衣原体感染细胞中的表达研究：

分析沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）L2血清型在急性感染和持续感染两种状态下,其基因CT259、CT703的mRNA及蛋白表达,为进一步研究两基因的生物学效应奠定实验基础。

方法：

1、用IFN-γ处理Ct感染的HeLa细胞,吉姆萨染色光学显微镜观察、以及电镜观察,确定沙眼衣原体持续感染细胞模型建立。

2、采用RT-PCR方法检测基因CT259、CT703 mRNA在不同细胞模型中的表达。

3、采用Western-blot的方法检测基因CT259、CT703编码蛋白在不同细胞模型中的表达。

结果：

1、成功建立Ct持续感染细胞模型。

2、RT-PCR结果显示:Ct持续感染状态下,在宿主细胞中6h开始检测到CT259的表达,12小时开始检测到CT703的表达,持续感染状态下CT259、CT703的表达量无时间依赖性;Ct急性感染状态下,在宿主细胞中6小时开始检测到CT259的表达,12小时开始检测到CT703的表达,随感染时间的延长CT259、CT703 mRNA表达量逐渐增加,具时间依赖性。将持续感染与急性感染各相同时间点CT259、CT703 mRNA灰度值相比较,发现持续感染状态下CT259、CT703 mRNA表达水平明显低于急性感染状态,差别具有统计学意义（P＜0.05）。

3、Western-blot结果显示:Ct持续感染状态下,在宿主细胞内24h可检测到CT259和CT703的表达,表达量无时间依赖性;Ct急性感染状态下,24h可检测到CT259和CT703的表达;随感染时间的延长,蛋白质表达量逐渐增加,具时间依赖性;相同时间点持续感染状态下CT259、CT703编码蛋白的量明显低于急性感染状态。

结论：

1、成功建立沙眼衣原体持续感染细胞模型。

2、Ct持续感染状态下基因CT259、CT703 mRNA水平显著低于急性感染状态。

3、Ct持续感染状态下基因CT259、CT703编码蛋白水平显著低于急性感染状态。