大鼠小肠隐窝上皮细胞的培养步骤及应用！

一、背景

大鼠小肠隐窝上皮细胞是来源于18-24日龄的雄性Charles River Sprague Dawley(CD(SD))大鼠小肠的正常上皮细胞。IEC-6细胞可以合成纤维连接蛋白和胶原，具有体内肠上皮细胞特异性的细胞表面抗原，生长受到皮质醇的抑制。IEC-6细胞是一种有限细胞系，细胞在老化前保持恒定的生长速度和细胞形态。

二、大鼠小肠隐窝上皮细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11965-092)，90%；北美胎牛血清(United States，GIBCO，货号16000-044)，10%，添加0.1u/mL胰岛素。

2）大鼠小肠隐窝上皮细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）大鼠小肠隐窝上皮细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、大鼠小肠隐窝上皮细胞处理：

1）复苏大鼠小肠隐窝上皮细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）大鼠小肠隐窝上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）大鼠小肠隐窝上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

三、应用

大鼠小肠隐窝上皮细胞可以用于补中益气丸对IEC-6细胞损伤模型NLRP3炎性体及相关细胞因子的影响：

实验采取大鼠小肠隐窝上皮细胞(Intestinal epithelial cell,IEC-6)损伤模型,分析补中益气丸含药血清干预后NLRP3炎性体及其相关炎症因子的变化,进一步探讨补中益气丸的药物作用机制。

内容：1、补中益气丸含药血清对IEC-6细胞损伤模型干预后细胞增殖的影响比较TNBS大鼠模型血清与TNF-α刺激对IEC-6细胞后引起的细胞损伤,建立细胞损伤模型,同时观测补中益气丸含药血清对IEC-6损伤模型的影响。

方法：分别用TNF-α和TNBS大鼠模型血清刺激IEC-6后,加补中益气丸含药血清干预,采用CCK-8法检测补中益气丸含药血清作用24h后细胞增殖情况。结果:与胎牛血清组相比,TNF-α对细胞增殖具有明显抑制作用(P<0.01)。与空白对照组相比较,TNBS大鼠模型血清刺激后对细胞的增殖同样有抑制作用(P<0.01),与TNF-α刺激后相比较,血清刺激后对细胞增殖的影响相对较小,TNBS大鼠模型血清刺激后,补中益气丸含药血清对细胞有明显的促进作用(P<0.01),细胞增殖能力有所恢复。

2、补中益气丸含药血清对IEC-6细胞损伤模型干预后NLRP3、Caspase-1、ASCmRNA表达的影响核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成员NLRP3作为NLRP3炎性体的危险信号感受器,通过内源和外源危险因素刺激激活后,与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)组装成NLRP3炎性体,激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(Caspase-1),进而促进促炎因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18(Interleukin-18,IL-18)的剪切,成熟和分泌,同时促进有促炎和抗炎双重性的细胞因子IL-33的成熟和分泌,通过下游信号转导通路,引发一系列炎症和免疫反应,参与溃疡性结肠炎的发生与发展。

通过探讨补中益气丸对损伤后IEC-6细胞NLRP3、Caspase-1、ASCmRNA表达的影响,从而分析补中益气丸对细胞损伤的修复机制。

方法：用10%模型血清复制细胞损伤模型,10%补中益气丸含药血清和10%柳氮磺吡啶对损伤后的细胞干预24h后,采用实时定量荧光PCR方法检测IEC-6细胞中NLRP3、Caspase-1、ASCmRNA表达,并对其进行统计学分析。

结果：与空白对照组相比,模型对照组NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA的表达有升高的趋势;与模型对照组相比,补中益气丸组NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA的表达有降低的趋势,柳氮磺吡啶组NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA的表达有降低的趋势。

3、补中益气丸含药血清对损伤后IEC-6细胞NLRP3炎性体相关蛋白表达的影响观察补中益气丸含药血清对损伤后IEC-6细胞NLRP3炎性体相关蛋白表达的影响,进而分析补中益气丸对细胞损伤的修复机制。

方法：用10%模型血清复制细胞损伤模型,10%补中益气丸含药血清和10%柳氮磺吡啶对损伤后的细胞干预24h后,采用Western blot方法检测IEC-6细胞中NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白的表达,并进行统计学分析。

结果：与空白对照组相比,模型对照组的NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白相对表达量增高(P<0.01);与模型对照组相比,BZYQW组的NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白相对表达量降低(P<0.05,P<0.01);SASP组的NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白相对表达量明显降低(P<0.01)。