人羊膜细胞的背景与应用及培养操作步骤！

一、背景

人羊膜细胞起源是正常羊膜，但随后通过同工酶分析、HeLA标记染色体和DNA指纹法分析，WISH细胞的起源是HeLa细胞污染的。WISH细胞角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性。注意：WISH细胞包含HeLa标记染色体，是从HeLa污染细胞中建株的。

二、人羊膜细胞培养步骤

1、复苏人羊膜细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2、人羊膜细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）、对于贴壁人羊膜细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3、人羊膜细胞冻存：

（1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

（3）用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

（4）先将细胞冻存管放置于-201.5h，然后将其移入-80。

三、应用

人羊膜细胞可以用于人羊膜细胞的原代培养和在型胶原蛋白支架上的三维培养用于修复胎膜破口的研究：

建立人羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞的分离培养和细胞纯化的方法;选择促进人羊膜细胞增殖的最佳培养基;构建人羊膜细胞/型胶原蛋白支架复合物以用于修复胎膜破口的研究。

方法：

1、通过酶消化法对羊膜上皮细胞和间质细胞进行分离和纯化。应用免疫细胞化学方法对人羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞进行细胞鉴定。

2、利用分光光度剂测定人羊膜细胞在4种不同的培养基下的细胞增殖状况。组:DMEM/F12+10S+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰岛素+5ug/ml转铁蛋白+0.1ng/ml T3;组:DMEM/F12+10S;组:DMEM/F12+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰岛素+5ug/ml转铁蛋白+0.1ng/ml T3;组:DMEM/F12+50.0ng/mlEGF。

3、将羊膜间质细胞嵌入三维基质中,羊膜上皮细胞接种在基质的表面,构建人羊膜细胞/型胶原蛋白支架复合物以模拟人体羊膜组织结构。

4、DAPI标记三维基质中的细胞核以计数人羊膜细胞在三维培养第2,8天的细胞数量。耦合罗丹明的鬼笔环肽染色标记可特异性地显示细胞骨架中的微丝(F-actin)结构以观察细胞在三维基质中的细胞形态。扫描电镜和透射电镜观察羊膜上皮细胞和间质细胞在三维培养中的超微结构。

5、培养含有不同数量羊膜间质细胞的人羊膜细胞/型胶原蛋白支架复合物,15 d后检测抗张强度。

结果：

1、采用胰蛋白酶和胶原酶先后消化的方法可以将羊膜上皮细胞和间质细胞进行细胞分离培养。人羊膜细胞体外培养表现出良好的细胞增殖能力和传代能力。

2、羊膜间质细胞在缺少胎牛血清的培养基里缺乏增殖能力。人羊膜细胞在含有胎牛血清、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白及三碘甲腺原氨酸的培养基里表现出较其余3组更强的细胞增殖能力(P<0.001)。(羊膜上皮细胞组:1.130±0.203;组:0.487±0.141;组:0.466±0.094;组:0.451±0.144。羊膜间质细胞组:1.356±0.173;组:0.930±0.112;组:0.200±0.053;组:0.190±0.029)。

3、人羊膜上皮细胞和间质细胞在型胶原蛋白基质中的培养显示出与体内人羊膜细胞的相似性,人羊膜细胞在三维培养的过程中细胞数量无明显增加,人羊膜间质细胞可导致型胶原蛋白的收缩,抑肽酶和GM6001也不能抑制这种收缩。

4、人羊膜细胞/型胶原蛋白复合物抗张强度随人羊膜间质细胞数量的增多而增强(P<0.001)。

结论：

1、羊膜上皮细胞和间质细胞能够在体外分离、扩增,这为运用人羊膜细胞进行细胞治疗和组织工程技术奠定了实验基础。

2、型胶原蛋白有望应用在人羊膜细胞组织工程,三维细胞基质培养系统有望为胎膜早破提供新的研究方法和治疗手段。