小鼠胚胎瘤细胞的背景与应用及培养操作步骤！

一、背景

小鼠胚胎瘤细胞是来源于畸胎瘤细胞的小鼠软骨发生细胞系，在胰岛素刺激下，分化成软骨细胞，形成软骨小结，表达型胶原和X型胶原最后发生矿化，反映软骨发生过程。

二、细胞培养操作步骤

1、小鼠胚胎瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备：DMEM（推荐iCell-0001）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）小鼠胚胎瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。换液频率：每周2-3次

3）小鼠胚胎瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

2、小鼠胚胎瘤细胞处理：

1）冻存小鼠胚胎瘤细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）小鼠胚胎瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于小鼠胚胎瘤细胞传代可以参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10S的培养基来终止消化。

3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）小鼠胚胎瘤细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1、小鼠胚胎瘤细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。

三、应用

小鼠胚胎瘤细胞可以用于共培养体系中不同代数的软骨细胞对ATDC5细胞软骨分化影响的实验研究：

基于三维共培养体系,将不同代数的猪关节软骨细胞(ACs)转染后与小鼠胚胎瘤细胞(ATDC5)包裹在水凝胶中以建立可有效释放生长因子的共培养体系,探索不同代数软骨细胞对生长因子释放的影响规律及共培养体系中ATDC5细胞的成软骨分化效果的影响。

方法：

1、小鼠胚胎瘤细胞与猪软骨细胞的获取及、培养及传代小鼠胚胎瘤细胞购自美国圣地亚哥的百奇生物公司,置于含有ATDC5培养液的150cm2培养瓶中进行培养。采用酶解法从新鲜猪关节的软骨组织中获取猪软骨细胞,置于软骨培养液中培养至第一代(P1)、第三代(P3)、第五代(P5)以供实验使用。

2、观察软骨细胞的形态学特征及检测软骨相关基因的表达情况在软骨细胞体外扩增培养过程中,应用倒置显微镜观察不同代数软骨细胞的形态学变化,实时定量PCR(q-PCR)检测软骨细胞型胶原蛋白(Col)、型胶原蛋白(Col)和聚集蛋白聚糖(ACAN)基因的表达水平。

3、腺病毒转染软骨细胞及构建水凝胶三维共培养体系用携带转化生长因子β3(TGF-β3)基因的重组腺病毒分别转染P1、P3、P5软骨细胞,并在转染后第二天利用荧光显微镜观察病毒转染效果。随后分别取一定数量已转染的软骨细胞并与提前培养好的ATDC5细胞按照1:3的比例混合,离心弃上清后用海藻酸钠溶液重悬细胞混合物,在CaCl2溶液交联作用下将海藻酸钠/细胞混合液制作成凝胶微球,最后转移至含有软骨诱导液的24孔板进行28天的培养,并将这三组实验组分别命名为P1、P3、P5组。

4、检测TGF-β3的释放情况及评估体外软骨分化效果。在规定的时间点收集共培养体系中的培养液,利用Elisa检测培养液中TGF-β3的浓度,并评估不同实验组之间TGF-β3的控释效果。在水凝胶中成软骨诱导过程的第28天,收集实验样本,并利用q-PCR评估相关成软骨特异性基因的表达,同时应用hematoxylin-eosin(HE)染色及免疫组化观察软骨标志蛋白的分泌情况;根据获得的数据,评估体外成软骨效果。

结果：

1、本实验提取的新鲜原代软骨细胞在体外单层培养达到80%融合后传代至P1、P3、P5后使用。在此过程中,原代软骨细胞呈多角度形,传代之后的软骨细胞,细胞形态由多角形向梭形或类椭圆形变化;q-PCR检测软骨相关标志基因的结果显示,P1中的ACAN与Col基因表达相对较高,随着代数的增加,ACAN与Col基因表达下降,同时伴随着Col基因的表达上调,说明软骨细胞出现去分化现象。

2、将携带TGF-β3基因的腺病毒感染P1、P3、P5软骨细胞,转染后第二天,利用荧光显微镜观察转染效率,可观察到三组细胞均有明显的荧光表达,转染效率均达到95%,其中P5组荧光强度最高,同时能观察到细胞生长状况良好。