SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系的培养操作规程！

一、背景

SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系是由A·Leibovitz在1974年从第一期移行细胞瘤中建立的细胞株，该患者接受过术前化疗(Thiotepa)；报道称该细胞的植板率为41%。

二、SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系培养操作规程

1、SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

准备H-DMEM培养基，90%；优质胎牛血清，10%。

SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37，培养箱湿度为70%-80%。

SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系细胞处理：

1）复苏SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系细胞，传代可参考以下方法：

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系1-2次。

加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化2-3分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1200RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

3）SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。

三、应用

SW780人膀胱移行癌贴壁细胞系可以用于蛇葡萄素（Amp）诱导人膀胱癌细胞株SW780凋亡的研究：

研究蛇葡萄素体外对人膀胱癌细胞株SW780增殖的抑制作用及凋亡机制的探索。

方法：采用MTT比色法检测Amp处理人膀胱癌细胞株SW780 48h、72h后对其增殖的抑制作用;

荧光显微镜观察不同浓度Amp作用人膀胱癌细胞株SW780后细胞的凋亡状态的变化情况;

采用激光共聚焦显微镜检测不同浓度Amp对人膀胱癌细胞株SW780线粒体膜电位、细胞pH值及细胞内Ca2+度的影响;

Western Blot检测不同浓度Amp作用于人膀胱癌细胞株SW780 48 h后p-Bcl-2、Bax与Cleaved caspase-3蛋白的表达情况与Amp 150μgml处理人膀胱癌细胞SW780 12 h、24 h、48 h后p-Bcl-2、Bax与Cleaved caspase-3蛋白的表达情况。

结果：MTT法体外实验结果表明:在Amp浓度分别为60μg/ml、72μg/ml、87μg/ml、104μg/ml、125μg/ml和150μg/ml时对人膀胱癌细胞株SW780增殖具有明显的抑制作用,Amp作用于人膀胱癌细胞株SW780 48 h、72 h时,IC50值分别为83.91±2.15μg/ml、66.52±3.60μg/ml。

荧光显微镜观察不同浓度Amp作用于人膀胱癌细胞株SW780的凋亡状态显示:Amp药物处理组均可引起细胞不同程度的凋亡,与阴性对照组相比,药物浓度越大,细胞凋亡特征越明显,凋亡数量越多。

激光共聚焦显微镜检测不同浓度Amp处理人膀胱癌细胞株SW780后线粒体膜电位变化显示:Amp药物处理组均可引起线粒体膜电位荧光强度降低,并且药物浓度越大,线粒体膜电位荧光强度越低,呈现明显的剂量依赖性;测定不同浓度Amp作用于人膀胱癌细胞株SW780细胞内Ca2+浓度变化显示:Amp药物处理组均可引起细胞内荧光强度增高,并且药物浓度越大,细胞荧光强度越大,呈现明显的剂量依赖性;测定不同浓度组Amp作用于人膀胱癌细胞SW780线粒体内pH值变化显示:Amp药物处理组与阴性对照组差别不大,均呈现较强荧光强度,无剂量依赖性。

Western Blot检测不同浓度Amp作用于SW780后Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2、Bax与Cleaved caspase-3蛋白表达显示:与阴性对照组比较,随着药物浓度的增大,Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2蛋白表达量降低,Bax蛋白表达量增高,Cleaved caspase-3蛋白表达量增高,呈现明显的剂量依赖性。Western Blot检测Amp(150μg/ml)处理细胞SW780 12 h、24 h、48 h后Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2、Bax与Cleaved caspase-3蛋白表达显示:与阴性对照组比较,随着药物作用时间的延长,Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2蛋白表达量降低,Bax蛋白表达量增高,Cleaved caspase-3蛋白表达量增高,呈现明显的时间依赖性。

结论：1、Amp对人膀胱癌细胞株SW780增值具有明显的抑制作用,并呈现时间和浓度依赖性。

2、Amp体外可以通过线粒体途径诱导人膀胱癌细胞株SW780的凋亡。