人子宫颈鳞状细胞癌细胞的培养步骤及应用研究！

一、背景

人子宫颈鳞状细胞癌细胞是建自一个日本病人的外科手术的原位组织样品。电镜观察表明，在SiHa细胞连接处有典型的桥粒，在SiHa细胞胞质中有丰富的张力丝。在裸鼠中，SiHa细胞能形成低分化的表皮样癌(级)；SiHa细胞中，癌基因PRB和p53阳性。

二、人子宫颈鳞状细胞癌细胞培养步骤

1）复苏人子宫颈鳞状细胞癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL*培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）人子宫颈鳞状细胞癌细胞传代：如果人子宫颈鳞状细胞癌细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人子宫颈鳞状细胞癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，人子宫颈鳞状细胞癌细胞脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将人子宫颈鳞状细胞癌细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）人子宫颈鳞状细胞癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，人子宫颈鳞状细胞癌细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90S+10%DMSO。

三、应用

人子宫颈鳞状细胞癌细胞可以用于子宫颈鳞状细胞癌细胞凋亡及间质重构机制的研究：

通过对细胞凋亡（apoptosis）、细胞增殖、细胞外间质成分及部分相关调控蛋白的表达进行检测，探讨子宫颈鳞状细胞癌细胞凋亡和间质重构的机制及与肿瘤侵袭性生长的关系。

方法：应用原位末端标记法（TUNEL）、双重荧光免疫染色等技术对正常子宫颈组织及不同分化程度的子宫颈鳞状细胞癌组织增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞凋亡及相关调控基因caspase-3、caspase-8、Bax、Bc1-2、Fas、Fasl蛋白的表达和间质、、型胶原、纤粘连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）及相关调控金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MT1-MMP、TIMP-2的表达进行检测，利用共聚焦显微镜观察荧光染色结果。

结果：TUNEL法检测发现，每例标本均有不同程度的细胞凋亡及PCNA的表达，但阳性细胞数量及分布区域不完全相同。在正常子宫颈组织中，凋亡细胞主要分布于鳞状上皮上1/3层，而PCNA阳性细胞主要分布于鳞状上皮下1/3层；鳞状上皮下细胞外间质内可见结构致密的、型胶原的表达，型胶原和LN蛋白呈线状环绕于血管及上皮下基底膜内，FN呈细条索状分布于基底膜和间质内。鳞状上皮中下层细胞、少数间质细胞、血管内皮及平滑肌细胞可见MMP-1、MMP-2、MT1-MMP、TIMP-2较弱荧光。正常子宫颈及鳞状细胞癌组织中均有caspase-3、Fas、FasL蛋白的表达，阳性细胞分布区域与同一标本的凋亡细胞一致。

鳞状细胞癌组织中，PCNA阳性细胞、凋亡细胞及几种细胞凋亡相关调控蛋白的表达均明显增多，癌细胞分化程度越低，蛋白表达越明显。双重荧光染色显示，部分间质及肿瘤细胞可见caspase-3或Fas蛋白与凋亡同时阳性染色，与Bax双染的细胞主要是一些间质细胞。正常子宫颈及鳞状细胞癌组织中未发现caspase-8和Bcl-2蛋白表达。

子宫颈鳞状细胞癌组织中，三型胶原表现为明显降解：、型胶原结构稀疏，排列紊乱；癌细胞团周围基底膜内的型胶原的线状荧光减弱、断裂甚至缺失，尤其以低分化鳞状细胞癌明显，FN和LN蛋白表达增多，并与癌细胞分化程度负相关。