小鼠黑色素瘤细胞（鸡OVA基因修饰）的培养方法！

一、细胞简介

平台编号：Bio-126977

规格：1×10Cells/T25培养瓶

细胞信息：B16-OVA

细胞名称：小鼠黑色素瘤细胞（鸡OVA基因修饰）B16-OVA

产品规格：T25培养瓶x1 1.5ml冻存管x2

细胞数量：1x10^6 1x10^6

保存温度：37-198

运输方式：常温保温运输干冰运输

安全等级：1

用途：仅供科研

培养体系：RPMI 1640(w/o Hepes)10S；0.05 mM 2-mercaptoethanol+0.4 mg/ml G418

培养温度：37

二氧化碳浓度：5%

简介：小鼠黑色素瘤细胞（鸡OVA基因修饰）B16-OVA又名B16-MO4；B16 clone M04;M04;MO4。取自C57BL/6小鼠，雄性。鸡OVA基因修饰。

用途：细胞系

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、细胞特性

1）来源：小鼠黑色素瘤

2）形态：成纤维细胞样，贴壁生长

3）含量：>1x106 个/mL

4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5）规格：T25 瓶或者1mL 冻存管包装

三、细胞的运输和保存

使用T25 瓶充液发送活细胞。收到细胞后，请先在显微镜下检查细胞生长状态，并将T25 瓶置于培养箱约6h 或过夜后，再次检查细胞状态。若状态良好，可按照以下细胞培养步骤进行细胞后续处理操作。若发现可疑污染物，请及时与我们取得联系。

四、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号31800022, 添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L, 丙酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37 摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，补加1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml 含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO 后进行冻存。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。

2、加2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2 到1：5 的比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

五、验收细胞注意事项

1、收到小鼠黑色素瘤细胞（鸡OVA基因修饰）B16-OVA细胞，请查看瓶子是否有破裂，培养基是否漏出，是否浑浊，如有请尽快联系。

2、收到小鼠黑色素瘤细胞（鸡OVA基因修饰）B16-OVA细胞，如包装完好，请在显微镜下观察细胞。,由于运输过程中的问题，细胞培养瓶中的贴壁细胞有可能从瓶壁中脱落下来，显微镜下观察会出现细胞悬浮的情况，出现此状态时，请不要打开细胞培养瓶，应立即将培养瓶置于细胞培养箱里静止3-5小时左右，让细胞先稳定下，再于显微镜下观察，此时多数细胞会重新贴附于瓶壁。如细胞仍不能贴壁，请用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，如台盼蓝染色证实细胞活力正常请按悬浮细胞的方法处理。

3、收到小鼠黑色素瘤细胞（鸡OVA基因修饰）B16-OVA细胞后，请镜下观察细胞，用恰当方式处理细胞。若悬浮的细胞较多，请离心收集细胞，接种到一个新的培养瓶中。弃掉原液，使用新鲜配制的培养基，使用进口胎牛血清。刚接到细胞，若细胞不多时血清浓度可以加到15％去培养。若细胞迏到80%左右，血清浓度还是在10％。

4、收到小鼠黑色素瘤细胞（鸡OVA基因修饰）B16-OVA细胞时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过80%汇合度时，将培养瓶中培养基吸出，留下5-10ML培养基继续培养：超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液，1000转/分钟离心3分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。

5、将培养瓶置于37培养箱中培养，盖子微微拧松。吸出的培养基可以保存在灭菌过的瓶子里，存放于4冰箱，以备不时之需。

6、24小时后，细胞形态已恢复并贴满瓶壁，即可传代。（贴壁细胞）将培养瓶里的培养基倒去，加3-5ml（以能覆盖细胞生长面为准）PBS或Hanks’液洗涤后弃去。加0.5-1ml 0.25%含EDTA的胰酶消化，消化时间以具体细胞为准，一般1-3分钟，不超过5分钟。可以放入37培养箱消化。轻轻晃动瓶壁，见细胞脱落下来，加入3-5ml培养基终止消化。用移液管轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后将溶液吸入离心管内离心，1000rpm/5min。弃上清，视细胞数量决定分瓶数，一般一传二，如细胞量多可一传三，有些细胞不易传得过稀，有些生长较快的细胞则可以多传几瓶，以具体细胞和经验为准。（悬浮细胞）用移液管轻轻吹打瓶壁，直接将溶液吸入离心管离心即可。

7、贴壁细胞，悬浮细胞。严格无菌操作。换液时，换新的细胞培养瓶和换新鲜的培养液，37，5%CO2培养。

特别提醒：原瓶中培养基不宜继续使用，请更换新鲜培养基培养。